猪流感病毒的分离与鉴定

摘　要：从广东某猪场表现发热和流鼻涕等呼吸道症状的猪群采集28份样品，用鸡胚分离到9株病毒。将病毒传代至第6代，经血清学鉴定、理化特性检查、电镜观察、生物学特性检查和人工致病试验，结果表明，4株分离株为H1N1亚型猪流感病毒，5株为H3N2亚型猪流感病毒。

关键词：猪流感病毒；分离鉴定；生物学特性

猪流行性感冒(Swine influenza， SI)是由正黏病毒科 A型流感病毒属的猪流感病毒 (Swine influenzavirus，SIV)引起猪的一种急性、高度接触传染性、群发性呼吸道疾病，临床以突发、高热、精神沉郁、流鼻涕、体重下降、咳嗽、呼吸困难、反复发作、衰竭为特征[1-4]。该病一旦发生，传播迅速，发病率可高达100%；各年龄、性别、品种猪均能感染，发病急促，恢复缓慢，阻碍增重，降低肉料比，直接影响猪群健康状态和质量，值得重视的是，SIV与PRRSV、PCV-2、PRV、猪附红细胞体、放线杆菌、猪巴氏杆菌和猪链球菌等病原常发生继发或混合感染，使病情变得复杂而反复[5-7]，因此，该病是企业化养猪场普遍存在且难以根除的猪呼吸道疾病之一[8-9]。

1　材料与方法

1.1　标准阳性血清和抗原等

新城疫病毒(NDV)，减蛋综合症(EDS-76)阳性血清和H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子抗血清均由华南农业大学家禽研究室提供；SPF鸡胚购自北京梅里亚公司；猪流感病毒H1、H3、H5、H7、H9标准阳性血清。

1.2　样品

从疑似猪流感的猪场采集28份鼻拭子或病死猪的气管和肺病料，置于含双抗的50%甘油保存液中，－20 ℃保存备用。

1.3　主要试剂和实验动物

猪流感病毒抗体阴性的50日龄仔猪6头；RNA抽提和RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司。

1.4　病毒的分离和鉴定

按文献[1-2]的方法进行病毒的分离和培养。红细胞凝集(HA)试验按常规微量法进行。将HA阳性的鸡胚液与ND，EDS-76，AIVH5，H7，H9标准阳性血清进行红细胞凝集抑制(HI)试验，其操作程序与判定标准按文献进行。SIV亚型的鉴定及命名、电镜观察、红细胞凝集试验参照文献[1,10]进行。SIV血凝素热稳定性试验、耐热性试验、乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、耐酸性试验和ELD50的测定参照文献[11]进行。

1.5　猪体回归试验

将菌检阴性的病毒液作1∶10稀释，经鼻腔和肌肉注射途径接种，每株病毒接种2头，2.0mL/头，对照2头。每日检测体温2次，观察1周；采集攻毒前和攻毒后1周、2周血清，进行HI试验；2周后扑杀，观察病理变化；取鼻拭子、气管和肺脏进行RT-PCR鉴定。

1.6　RT-PCR鉴定

根据GenBank已发布的SIV NP基因序列，设计一对引物，预期目的片段长度约300 bp；引物由Invitrogen公司合成。

上游引物P1：5′-CAG GTA TTG GGC TAT AAG GAC CAG-3′

下游引物P2：5′-TAC TCC TCT GCA TTG TCT CCG AAG-3′

2　结果

2.1　病毒的分离及初步鉴定

28份鼻棉拭子有9分样品的鸡胚液对豚鼠红血球有血凝活性，经鸡胚传代，第6代病毒液HA价达到9 log2～11log2，与抗NDV、EDS-76、AIVH5、H7、H9阳性血清的HI试验为阴性，将疑为SIV的分离物送北京国家流感中心进行鉴定，其中4株为H1N1亚型SIV,5株为H3N2亚型SIV。根据流感病毒通用命名法则，分别命名见表1。

表1　SIV分离株的命名及其缩写

Table 1　The Name and abbreviation of SIV isolates

第6代分离株在电镜可看到大量杆状、棒状、椭圆形及球形病毒粒子，大小约80 nm～120 nm(图1)。

图1　SIV负染病毒粒子电镜照片(10 000×)

Fig.1　Electron micrograph of swine influenza virus particles

2.3　红细胞凝集试验

SIV分离株只对公鸡和豚鼠红细胞有凝集作用，对其他动物红细胞无凝集作用。

2.4　血凝素热稳定性试验

SIV分离株在56 ℃水浴5 min，其血凝价下降2个滴度，其血凝素为热不稳定型；有的血凝价不下降为热稳定型(表2)。

表2　不同SIV分离株血凝素热稳定性测定结果

Table 2　The test results of heat stabilities of hemagglutinin indifferent SIV isolates

2.5　耐热性试验、乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、耐酸性试验

将分离毒株在4 ℃放置60 min，对其鸡胚的感染性不变，而经50 ℃处理30 min和60min部分接种鸡胚已检测不到HA效价，若在60 ℃处理10 min，接种鸡胚则完全测不到HA效价，表明SIV分离株均对热敏感。

将分离毒株经乙醚、氯仿和酸处理，接种鸡胚96h后，经乙醚、氯仿处理的能检测到鸡胚尿囊液中的HA效价，而经酸处理的未检测到鸡胚尿囊液中的HA效价，说明SIV分离株对乙醚、氯仿不敏感，而对酸敏感。

2.6　EID50测定

将SIV分离毒稀释后分别接种鸡胚，不能导致鸡胚的死亡。经测定，EID50分别为10－6/0.2 mL～ 10－7/0.2 mL。

2.7　动物感染试验

60日龄猪接种SIV病毒后，3 d～4 d开始出现体温升高，有的体温可达41℃；厌食，呼吸极度困难，不愿走动。攻毒后第6天较为严重，2周后，猪只症状消失，趋于康复。

试验猪只攻毒4 d后，其抗体水平开始轻微的上升；1周后抗体效价可达26；2周后抗体水平可高达29。

第1周剖检2头猪，其病理变化主要在呼吸系统较为明显。表现为咽喉和支气管充血并含有大量的黏液；肺呈鲜红色，颈淋巴结和纵隔淋巴结肿大，充血和水肿。

2.8　动物感染试验的RT-PCR鉴定

从回归试验猪的病料中能分离出猪流感病毒。并通过RT-PCR检测，可扩增出预期的条带(图2)。

M.DNA标准DL 2 000； 1.阴性对照；2.鼻拭子；3.气管；4.肺脏

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2.Nasal swab；

3.Trachea；4.Lungs

图2　RT-PCR 扩增结果

Fig.2　The results of RT-PCR

3　讨论

本研究在广东某猪场采集出现呼吸道症状的猪鼻拭子和病死猪的气管、肺病料，经处理后接种鸡胚进行病毒分离，分离到9个SIV分离株，这些毒株能在鸡胚中复制并传代；经HI和RT-PCR鉴定能确定4株为H1N1,5株为H3N2亚型流感病毒，表明猪群中H1N1和H3N2都是主要流行亚型。经对分离获得的SIV进行红细胞血凝活性研究试验，证明

不同毒株的血凝活性差异较大。研究表明广东部分猪场同时存在H1和H3亚型SIV，所分离的病毒表现出有一定的致病力，在所采集样品的猪场中表现发热、严重的呼吸症状，并造成大规模流行，但病死率不高。

流感病毒作为呼吸系统疾病的一个重要病原，在混合感染、并发感染和继发感染中具有一定的作用，给养猪业带来一定的经济损失，应引起重视。