猪戊型肝炎病毒单克隆抗体的抗原识别位点分析

摘　要：采用ELISA叠加试验，对6株具有ELISA反应特性的猪戊型肝炎病毒(SHEV)单克隆抗体(McAb-αC11、αC12、γH1、γF8、BC4和CH8)的抗原识别位点进行检测。抗体反应增值结果表明，6株单抗分别针对4个不同抗原位点，McAb-γH1，BC4，CH8识别的位点各不相同，其中McAb-γH1、BC4识别的位点有部分重叠，McAb-αC11、αC12，γF8识别同一位点，位于γH1，BC4识别位点的重叠区内。

关键词： 猪戊型肝炎病毒； 单克隆抗体； 抗原位点

抗原位点决定了蛋白质的抗原特性，对猪戊型肝炎病毒(Swine hepatitis Evirus，SHEV)的抗原位点进行分析一直是该研究领域中的热点，该研究有助于了解病毒的致病机制和推动新型疫苗的研制[1]。同时对了解单克隆抗体的生物学特性以及分析病毒抗原位点的差异、病毒的分型、疾病的鉴别诊断和治疗等有重要意义[2]。抗原位点是病毒表面的特殊立体构型和具有免疫特性的化学基团，与抗体结合具有高度特异性。一旦氨基酸组分、序列及空间构象发生改变，都会引起位点的改变， 继而导致病毒的抗原性变化。因此，利用这种抗原性的变化可以鉴别不同株系。抗血清是含有针对多个抗原位点的多克隆抗体， 不同株系间会产生相同的血清学反应，难以达到鉴别目的[3]。单克隆抗体(McAb) 以其特异性和同质性等常规免疫血清无法比拟的优点，成为检测病毒抗原位点的最佳生物探针[4]。本试验选用多株McAb对SHEV抗原位点和抗原性进行了分析， 探索了位点数量及相互关系，以分析不同毒株间的差异。

1　材料与方法

1.1　病毒株和杂交瘤细胞株

猪戊型肝炎病毒ORF2-M1蛋白由本室研制并保存；SHEVORF2-M1蛋白单克隆抗体(αC11、αC12、γH1、γF8、BC4、CH8)由本室研制；羊抗小鼠IgG-HRP(1∶1000稀释)为Sigma公司产品。

1.2　ORF2-M1蛋白的纯化

大量诱导ORF2-M1蛋白，用Qiagen公司的Ni-NTA His BindResin进行纯化，操作步骤按说明书进行。用PACKARD Bell紫外分光光度计测定蛋白含量。

1.3　ORF2-M1蛋白最适包被浓度的测定

根据方阵式[5]，测定抗原最适包被浓度。

1.4　各McAb的ELISA 试验及饱和值测定

用间接ELISA方法对各株McAb的ELISA效价进行预试验然后测定其饱和值[6]。绘制McAb饱和曲线图。

1.5　McAb叠加试验[7]

参照文献[7]，在确定各McAb饱和值的基础上，在ORF2-M1蛋白最适抗原包被的96孔酶标板内，加入一种饱和浓度McAb,37℃作用1 h，PBS7洗涤3次×5 min，然后加入另一种饱和浓度的McAb，同样孵育洗涤；分别加入1∶1000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，同样孵育洗涤；加入底物溶液显色，终止反应，测定OD492nm值，计算增值指数(AI)。按如下公式计算：

AI＝(A1＋2-A1)/A2×100%。式中：A1为McAb1的D492值；A2为McAb2的OD492nm值；A1＋2为McAb1叠加McAb2的D492值。AI<10% 为针对同一抗原位点，AI≥10 %为针对不同抗原位点，AI值越大，抗原位点重叠的可能性越小[7]。

2　结果

2.1　抗原纯化及蛋白含量测定

ORF2-M1蛋白经Ni-NTA His Bind Resin纯化，用PACKARD Bell紫外分光光度计测定蛋白含量为3.6784×106 g/L。

2.2　抗原最适包被浓度测定

当抗原为1∶6 400，抗体为1∶800稀释时，D492值约为1，P/N 为5.78>2.1，所以，选择抗原最适包被浓度为1∶6400(0.5 g/L)，空白对照符合要求，表明试验特异性比较强。

2.3　各McAb的ELISA饱和值测定

McAb达到一定浓度时，反应曲线呈现一平峰(图1～图6)。随着McAb稀释度增大，D492值开始下降，D492曲线下降前的McAb稀释度为该单抗的饱和工作浓度[8]。本试验中，McAb-αC11，αC12，γH1，γF8，BC4，CH8的饱和工作浓度及对应的D492分别确定为1∶1600(1.069)、1∶1 600(1.120)、1∶3 200(1.182)、1∶1 600(1.099)、1∶1600(1.018)、1∶1 600(1.061)。

图1　McAb-αC11对SHEV ORF2-M1蛋白的饱和曲线

Fig.1　Saturation curves of McAb-αC11 strains

图2　McAb-αC12对SHEV ORF2-M1蛋白的饱和曲线

Fig.2　Saturation curves of McAb-αC12 strains

图3　McAb-γH1对SHEV ORF2-M1蛋白的饱和曲线

Fig.3　Saturation curves of McAb-γH1 strains

图4　McAb-γF8对SHEV ORF2-M1蛋白的饱和曲线

Fig.4　Saturation curves of McAb-γF8 strains

图5　McAb-BC4对SHEV ORF2-M1蛋白的饱和曲线

Fig.5　Saturation curves of McAb-BC4 strains

图6　McAb-CH8对SHEV ORF2-M1蛋白的饱和曲线

Fig.6　Saturation curves of McAb-CH8 strains

2.4　McAb叠加试验

以抗原最适包被浓度(5 mg/L)包被ELISA板，先后分别加入2种饱和工作浓度的McAb，叠加后测定OD492值，计算增值指数(AI)，结果如表1所示。

表1　McAb叠加后D492值测定

Table 1　Determination of additivity index of the reaction betweentwo McAb

Note：Values in brackets are additivity index.

3　讨论

本试验选用的6株抗SHEV ORF2-M1蛋白单克隆抗体的单抗均能与SHEVORF2-M1蛋白起ELISA反应。在McAb的饱和曲线图中，当McAb稀释为某一滴度时，其对应D492值由平峰开始下降，McAb的该稀释度即D492值维持平峰的McAb最大稀释度，定为McAb的饱和工作浓度[9](图1～图6)。

用ELISA叠加试验分析McAb的抗原结合位点，是研究病毒抗原组分及其生物学活性的重要手段[10]。本试验结果显示，McAb-αC11，αC12，γF8相互叠加的增值指数均小于5%，增值不明显，说明3个单抗识别的位点可能相同。McAb-γH1，BC4，CH8彼此叠加后，增值指数均大于10%，表明其针对不同的抗原位点，其中γH1加BC4的AI为44.67%，BC4加γH1的AI为20.21%，说明BC4识别的位点或者其亲和力比γH1大；γH1加CH8的AI为19.31%，CH8加γH1的AI为76.31%，说明γH1识别的位点或者其亲和力比CH8大；αC11(αC12，γF8)加CH8的AI值与CH8加αC11(αC12，γF8)的AI值比较接近，说明αC11(αC12，γF8)与CH8识别的位点大小相仿。即McAb识别的位点或者其亲和力由大到小的顺序依次为BC4＞γH1＞CH8≌αC11(αC12，γF8)。McAb-αC11(αC12，γF8)加BC4、γH1的增值指数为55.34%～66.7%，而BC4、γH1加McAb-αC11(αC12，γF8)的增值小于10%，表明αC11(αC12，γF8)识别的位点位于BC4、γH1识别的位点内。

由此推断，6株McAb识别4个不同的抗原位点，即αC11(αC12，γF8)，BC4，γH1，CH8。其中BC4、γH1位点之间有部分重叠，αC11(αC12，γF8)位点位于其重叠区内。BC4、γH1识别的位点大，亲和力强。该结论提示，这组单抗可用于SHEVORF2-M1蛋白抗原表位分析、诊断试剂中优选抗原多肽及优势抗体的筛选，对生产实际具有重要的指导意义。至于这些抗原位点的分子构象和功能，尚有待于进一步研究。