摘 要：口蹄疫病毒P1和3C基因联合表达能够产生完整的口蹄疫病毒衣壳蛋白，并形成无核酸的与原病毒外形一致的全新的空衣壳，该空衣壳具有与口蹄疫病毒颗粒相同的抗原特性，免疫动物后能诱导产生抗口蹄疫病毒特异性中和抗体，是开发安全高效口蹄疫重组疫苗的理想途径。论文对口蹄疫P1、3C基因及其对应的蛋白功能和P1、3C基因联合表达研究进行综述，对P1、3C基因联合表达重组疫苗的潜在优点进行了讨论。
关键词：口蹄疫病毒；P1和3C基因；联合表达
口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)[1]。主要感染牛、羊、猪等偶蹄动物。口蹄疫病毒有7种血清型(A、O、C、Asial、SAT1、SAT2、SAT3)和几十种亚型，型与型之间不能交叉保护，且其遗传变异频率高，每年都有为数众多的新变异株出现，导致抗原差异大，给口蹄疫(FMD)疫苗研究、生产和通过免疫来预防口蹄疫带来了很大困难，长期以来，一直是困扰世界动物疫病防控工作的重大难题。
口蹄疫病毒基因组为单股正链RNA，约有8.5kb。基因组的中部是一个大的开放阅读框(ORF)，编码病毒的多聚蛋白，开放阅读框5′端编码L非结构蛋白，紧接着是4种结构蛋白基因和其他7种非结构蛋白基因。4种结构蛋白1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)和1D(VP4)为P1区，非结构蛋白基因区又分为P2和P3区。P2区编码2A、2B和2C3种蛋白；P3区编码3A、3B1(VPg1)、3B2(VPg2)、3B3(VPg3)、3C和3D4种7个蛋白。P1区编码的4种结构蛋白构成病毒衣壳蛋白，P2区和P3区编码的非结构蛋白以及前导L蛋白参与病毒RNA的复制、多聚蛋白的裂解和结构蛋白的折叠与装配过程。
对口蹄疫基因工程疫苗报道的很多，但大部分疫苗的研制仅仅基于结构蛋白VP1，可因为VP1只含有部分抗原位点，效果并不理想。研究表明，FMDV结构基因P1和非结构基因3C联合起来表达，可以产生完整的口蹄疫病毒衣壳蛋白，并形成无核酸的与原病毒外形一致的全新的空衣壳，该缺乏核酸的空衣壳具有与口蹄疫病毒颗粒相同的抗原特性，免疫动物后能诱导产生抗口蹄疫病毒特异性中和抗体。这可能是病毒衣壳和完全病毒粒子都具有中和抗体的主要靶目标，即两者有相似的抗原性。如果能够研制出表达FMDV空衣壳的重组疫苗就能彻底解决FMDV常规疫苗散毒的危险，预示其良好的应用前景，因而研究能够表达FMDV空衣壳的重组疫苗，一直是许多口蹄疫防御工作者研究的目标。
1 P1基因及编码蛋白的功能
P1基因全长约2 200 nt，包括1A、1B、1C和1D4个部分，分别编码85、218、220、213个氨基酸的结构多肽，分别称为VP4 、VP2 、VP3和VP1结构蛋白。4种结构蛋白最终形成五聚体单位构成FMDV衣壳蛋白，其具体形成过程是[2]：多聚蛋白经过初级裂解形成L-P1-2A、2BC、P3三种前体蛋白，多肽2A催化P1-2A从2BC连接处顺式切割，3C蛋白酶完成次级裂解，P1-2A被3C蛋白酶催化加工成VP0、VP3和VP1，这3种蛋白相互联系并能够自我组装成20面体的核衣壳，VP1、VP2、VP3位于FMDV衣壳的表面，VP4位于衣壳的内部。病毒衣壳蛋白具有决定病毒的抗原性、保护RNA免遭核酸酶降解、识别特异性细胞受体、决定宿主范围和组织嗜性，以及释放和传递病毒RNA通过细胞膜进入易感细胞内、指导选择和包装病毒RNA的功能。
对FMDV抗原位点的研究表明，FMDV抗原位点多位于病毒衣壳蛋白的环结构上，是由多个相互重叠的连续表位组成，包括形态表位和线性表位。结构蛋白P1区包含了FMDV的主要抗原位点，一个表位改变可影响该区域相邻表位与相应单克隆抗体的反应。口蹄疫病毒可诱导机体产生抗FMDV的体液免疫和细胞免疫，即FMDV不仅能诱导机体产生细胞免疫反应，还能诱导感染动物产生中和抗体，表明口蹄疫结构蛋白P1区具有很好的抗原性。
2 3C基因及编码蛋白的功能
非结构蛋白3C是P3区编码的蛋白之一，全长639nt，共编码213个氨基酸。3C蛋白酶是小RNA病毒的共同裂解酶，在多聚蛋白成熟过程中起着极为重要的作用。3C蛋白酶结构和功能与细胞的丝氨酸蛋白酶相似，催化P1多聚蛋白的次级裂解，与成熟病毒粒子的形成即病毒衣壳组装密切相关。3C蛋白酶还能裂解宿主的组蛋白H3，阻断宿主细胞的转录，并诱导对宿主细胞的翻译起始因子elF4A和elF4G的切割，关闭帽结构宿主细胞蛋白的合成，为病毒蛋白的合成创造条件[1]。
3 P1和3C的关系
3C蛋白酶催化P1聚蛋白的次级裂解，与成熟病毒粒子的形成即病毒衣壳组装密切相关。从FMDV衣壳蛋白形成过程来看，P1区编码的聚合蛋白在3C蛋白酶作用下被逐渐裂解为VP1、VP3和VP03种衣壳蛋白：这3种蛋白质紧密结合在一起，形成5 S原体，在由5个5 S组成一个12S的五聚体，12个五聚体又形成1个空壳病毒[1]。3C蛋白酶与特定抗原结构的形成密切相关，是构成有效全衣壳基因工程疫苗不可缺少的成分。研究表明，非结构蛋白3C是一种蛋白酶，功能就是催化多聚蛋白裂解，并且在11个蛋白酶裂解位点中，有9个位点是由3C蛋白酶完成的裂解过程[3]。病毒结构蛋白前体P1只有经3C蛋白酶裂解，才能产生成熟的病毒抗原。
4 P1和3C的联合表达
近年来，将FMDV结构蛋白基因P1作为免疫原基因用于基因工程疫苗的研究。FMDV的结构蛋白基因P1在3C蛋白酶的作用下裂解，组装成口蹄疫病毒空衣壳蛋白，该蛋白具有感染性病毒粒子的免疫原性和抗原性，利用其作为亚单位疫苗的免疫原基因是一种很好的选择。JanRoosien等将FMDV前体衣壳蛋白基因P12A及L、3C的cDNA导入苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)，在秋粘虫(sf9)细胞中表达出衣壳蛋白前体lA、1B、1C和1D，这为获得不含感染性RNA的空衣壳蛋白用于动物FMD的免疫提供了依据。Jae-KuOem等[4]利用杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞内表达FMDV非传染性五聚体样结构，应用阻断ELISA检测具有抗原性和免疫原性，经CsCl梯度离心具有与FMDV五聚体相同的沉降速度，电子显微镜观察显示该五聚体的结构和大小与FMDV五聚体结构和大小类似，免疫小鼠能产生特异性抗FMDV抗体。应用该五聚体建立的阻断ELISA能够用于检测FMDV特异性抗体，敏感性达98.5%，特异性达99.5%，均优于用FMDV灭活抗原制备的ELISA方法[5]。DusSantosMJ等[6]将FMDV编码结构蛋白的P1基因和编码蛋白酶的3C基因作为免疫原基因导入紫花苜蓿，免疫小鼠产生了特异性抗体并能抵抗强毒的攻击。WuQ等[7]用人腺病毒5型活病毒载体表达了FMDV A型和O型前体蛋白P1和蛋白酶3C基因，通过动物攻毒保护试验证实，所构建的重组病毒载体能诱导机体产生中和抗体，但复制缺陷型重组腺病毒不能长期稳定表达FMDV衣壳蛋白，会出现免疫耐受等问题。Sonia等将FMDVA24 P1和3C蛋白酶编码区插入Ad5，并将猪α干扰素(PIFN-α)插入到Ad5中作为分子佐剂，两者共同皮内免疫猪，42d后攻毒，发现4/5的猪获得完全保护。王炜等[8]将口蹄疫病毒P12A-3C基因通过根癌农杆菌介导法导入百脉根基因组，对转基因植株进行PCR、RT-PCR检测，表明外源基因整合在植物染色体基因组，并且具有转录活性，ELISA检测表明，转基因植株表达出外源目的蛋白。刘艳红等[9]将口蹄疫病毒A型两个不同毒株AV88(L)和XJ99的P12A和3C基因插入到逆转录病毒载体中，结果表明，获得了2个含不同RGD基序的A型FMDV衣壳蛋白和蛋白酶基因的重组逆转录病毒表达载体pBABE-AV88(L)P12X3C和pBABE-XJ99P1 2X3C，为研究安全、高效、低成本的FMDV空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。ZhengM等[10]将FMDVO/NY00衣壳蛋白P1和蛋白酶3C基因共同插入到鸡痘病毒载体中，构建重组鸡痘病毒vUTAL3CP1，表达产物用来免疫小鼠和豚鼠，结果证明这重组鸡痘病毒可以诱导小鼠产生明显的细胞免疫和体液免疫反应。免疫后检测到高水平的T淋巴细胞，CTL杀伤活性细胞，抗FMDV抗体及其中和抗体。此外，毒力试验结果表明，经Vutal3CP1免疫的豚鼠可获得完全保护。冷青文等[11]利用杆状病毒表达系统构建了包含有FMDVP12X3C3D多基因片段的重组杆状病毒，将该病毒感染昆虫细胞后，用SDS-PAGE及夹心ELISA方法检测目的蛋白的表达。结果表明，重组杆状病毒能够表达FMDV目的蛋白，表达产物能被口蹄疫阳性血清识别。
从以上可看出，利用口蹄疫病毒P1、3C基因的联合表达来研制安全高效的口蹄疫重组疫苗是切实可行的。如Abram CC等[12]证明P1和3C基因联合表达能产生少量的空衣壳蛋白，DusSantos MJ等[6]的紫花苜蓿P1和3C基因联合表达疫苗，可以使免疫小鼠抵抗强毒的攻击，Sonia等的P1和3C基因联合表达疫苗可以使4/5的猪获得完全保护。
随着分子生物学和基因工程的发展，口蹄疫病毒基因的表达已不再是棘手的问题，但目前很多研究仍处于实验室阶段，表达产量低，只能产生少量的病毒空衣壳，表达产物还不能用于实际生产，大都停留在表达研究阶段，应用研究阶段的工作还处于空白状态。病毒空衣壳的形成率及重组蛋白的纯化等都还需要进行大量的研究。另一方面，FMDV基因工程疫苗虽然解决了FMDV常规疫苗散毒的危险，但尚不具备与传统灭活疫苗竞争的实力，还应加强口蹄疫病毒抗原位点和动物免疫机理的研究。因此口蹄疫病毒P1、3C联合表达疫苗的研究中，如何研制出高效、安全、稳定的亚单位疫苗仍然是科研工作者的难题。对口蹄疫病毒P1、3C联合表达疫苗加快实验室研究进程，并使其产业化，以取得更大的经济效益和社会效益是今后努力的方向。