摘 要：猪捷申病是由猪捷申病毒(Porcine teschovirus，PTV)引起的猪脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤及无症状等多种表现的一种病毒性传染病。该病在大多数猪场呈隐性感染，其致病机制、分子机理、与其他病毒的相互作用尚不十分清楚。同时，该病在国内外研究较少。论文主要综述了猪捷申病毒的分子生物学研究进展，并对其研究前景进行了展望。
关键词：猪捷申病毒；小RNA病毒科；分子生物学
猪捷申病又称塔尔凡病(Talfan disease)和脑脊髓炎，是由猪捷申病毒(Porcine teschovirus，PTV)引起的猪脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤及无症状等多种表现的一种病毒性传染病；其中繁殖障碍主要表现为死木胎症候群即死产、木乃伊、死胎和不孕症以及新生胎儿畸形和水肿。该病最早暴发于原捷克斯洛伐克的捷申小镇，并具有高病死率(90%以上)。随后该病蔓延整个欧洲，给工业化养猪带来了巨大的经济损失。目前本病的报道很少，2003年我国内蒙古首次分离到该病毒[1]。
1 基本特性
PTV为小RNA病毒科(Picornavirudae)捷申病毒属(Teschovirus)成员，根据国际病毒分类，捷申病毒属只有1个血清型[2]。病毒粒子直径22nm～30 nm，圆形无囊膜。核心为单股正链RNA，外层包裹衣壳，没有脂蛋白。在氯化铯中的浮密度为1.33 g/cm3；耐酸，在pH2～9范围内，经24 h仍然稳定；无红细胞凝集性；对热抵抗力较强，56 ℃作用2 h,60 ℃作用15 min不能灭活，－70℃可长期存活。猪捷申病毒能在猪源细胞培养物中培养，并产生细胞病变(CPE)。不同毒株所产生的细胞病变不同，按形态分为：①细胞病变呈圆形，类似葡萄样聚合在一起，然后脱落；②细胞内有颗粒，周围有星状突起。实验室感染及免疫组化检测认为，捷申病毒的主要靶细胞为脑干神经细胞、脊髓灰质前角细胞和脊神经节细胞[3]。
2 猪捷申病毒粒子结构
猪捷申病毒是已知最小的动物RNA病毒，完整的病毒粒子由衣壳和RNA两部分组成。衣壳直径30nm，由60个壳粒组成。虽然猪捷申病毒的病毒粒子晶体结构还没有进行X线衍射技术分析，但是，其他的小RNA病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、牛肠道病毒、人鼻病毒16等的晶体结构已经清楚，所有的结构都惊人的相似：VP1、VP2和VP3各含有8个β片层和2个α螺旋结构，其中与β片层相连的环形结构位于壳粒的表面，C端位于壳粒的外侧，N端位于内侧，这些末端可以与其他蛋白质末端结合(包括与VP4结合)，使病毒衣壳更加稳定；VP2位于衣壳表面，其突起的氨基酸数量在小RNA病毒中变异最大，捷申病毒Talfan毒株的突起氨基酸长度为62个氨基酸[4]，比所有其他的小RNA病毒都长，而口蹄疫病毒和甲肝病毒没有这一结构；此外，猪捷申病毒VP2在衣壳表面的突起，尤其是突起的根部，可能是病毒最主要的抗原决定域[5]；VP4缺少二级结构，位于衣壳内部，N末端靠近20面体的5-对称轴，C末端靠近3-对称轴，N末端残基和肉豆蔻酸基团共价连接。
3 猪捷申病毒的基因组结构
猪捷申病毒基因组长约为7.2 kb，只有一个大的开放阅读框(ORF)，长度为6 615 bp或6 671bp(F65毒株)。基因组的5′端及3′各有一段非翻译区(5′-UTR和3′-UTR)。ORF编码一聚合蛋白，分结构蛋白及非结构蛋白。结构蛋白编码包括VP1、VP2、VP3和VP4，非结构蛋白包括2A、2B、2C及3A、3B、3C和3D。在5′-UTR和VP4基因之间具有一个前导序列。在基因组的最5′端有VPg和poly(U)相连。3′端末端具有poly(A)。基因的排列顺序为5′-UTR-L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′-UTR。
4 猪捷申病毒的感染与复制机制
小RNA病毒在敏感细胞的细胞浆内复制、包装和成熟，其中大多数小RNA病毒可以在组织培养细胞内生长，并常引起感染细胞发生颗粒变性，细胞变圆，48h～72 h内完全破坏。在体外培养中，猪捷申病毒的敏感细胞主要有IB-RS-2、PK-15等猪肾传代及原代细胞及BHK-21中培养。
猪捷申病毒的VP1 GH-环、VP1C末端突起结构及VP2突起结构可能共同直接参与了病毒-受体结合[5]，通过受体介导内吞进入宿主细胞，这和脊髓灰质炎病毒及脑心肌炎病毒极为相似。一系列抗病毒化合物如Winthrop即通过和VP1的袋状结构结合抑制病毒粒子和细胞受体的结合。
侵入细胞后，病毒粒子经历衣壳破裂、疏松和裂解，释放病毒基因组RNA进入胞浆。除口疮病毒外，小RNA病毒VP1内部的袋状结构都有来源于宿主细胞的天然脂肪酸。该脂肪酸除对脊髓灰质炎病毒和鼻病毒脱衣壳没有影响外，介导了其他小RNA病毒衣壳的稳定，它的释放是病毒粒子脱衣壳的前提。人工合成的WIN51711能抑制鼻病毒脱衣壳，原因在于它将袋中的脂肪酸替代下来，和VP1的袋状结构牢固结合。同时有研究表明，脂肪酸成分过多，对病毒衣壳的脱落有可逆抑制作用[6]。病毒衣壳的脱落也和早期VP4的参与有关。VP4的N末段和肉豆蔻酸脂连接，并进一步和细胞膜作用。衣壳脱落之前，衣壳经历剧烈的抗原转化，肉豆蔻酸脂携带VP4离开衣壳，随后基因组包裹在酸性包涵体中进入胞浆。
大部分小RNA病毒的侵入使宿主细胞的蛋白合成迅速停止，这种蛋白合成的抑制伴随着真核翻译起始因子4G(eIF4G)的裂解。eIF4G是帽子结合物(cap-bindingcomplete)eIF4F的一个亚基，另两个亚基为eIF4E(与帽子结构相结合)和eIF4A(具有ATP依赖的RNA解旋酶活性)。eIF4F与mRNA结合后，RNA的二级结构被打开，有利于核糖体的40S亚基和mRNA的结合。40S亚基与mRNA结合后沿着5′非编码区(5′-UTR)从5′到3′方向运行，直到遇到AUG起始密码子。这时核糖体的60S亚基与eIF-mRNA-40S复合物结合，多肽链的合成开始。真核细胞mRNA的m7G帽结构参与了起始因子eIF4F和核糖体结合，介导细胞蛋白的合成。小RNA病毒感染细胞后，自身合成特异的蛋白酶降解eIF4G，切断mRNA和核糖体的结合，阻断宿主细胞蛋白合成。而小RNA病毒的5′非翻译区(5′-UTR)内有复合结构即核糖体进入位点(internalribosome entry site，IRES)元件，在eIF4G裂解后，以IRES起始的病毒蛋白翻译水平一直维持，甚至提高[7]，蛋白翻译不受影响。
小RNA病毒主要有3种IRES。①以心病毒属和口疮病毒属成员为代表的IRES，该IRES在兔网织红细胞裂解物(rabbitreticulocyte lysate，RRL)中具有较高活性；②以肠道病毒属和鼻病毒为代表的IRES元件，该IRES在兔网织红细胞裂解物的活性较低，但可以被Hela细胞提取物激活。宿主细胞eIF4G或eIF4E降解或失活后，这两种IRES功能不受影响[8-9]。③以HAV为代表的IRES，它在RRL中的活性不受Hela提取物的影响，但却受肝脏的提取物影响[10]。同时，HAVIRES的翻译受eIF4G的影响，即eIF4G的降解在抑制宿主细胞蛋白表达的同时病毒蛋白的表达也受到了抑制[11]。
典型的小RNA病毒科IRES元件由450bp组成[8]并使用宿主翻译起始因子起始病毒蛋白的翻译，但PTV的5′非翻译区却只有280个碱基参与了体内外翻译的有效起始[9]。PTV的48S翻译起始复合物是由40 S的核糖体亚基和eIF2及Met-tRNAMet组成。而40S亚基和PTV的IRES结合形成二元复合物。后来有学者发现捷申病毒毒株TalfanIRES较短且3′端没有多聚嘧啶，同时2A蛋白降解eIF4G后，并不能提高TalfanIRES的活性[12]，且活性不受eIF4A影响[13]。同时，在结构上，PTV的IRES和小RNA病毒科其他病毒的IRES不同，而和丙型肝炎病毒(HCV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)[14]的IRES却有几分相似。此外，通过对多个病毒IRES的重组变异分析，Christopher等认为非编码区的非同源重组值得注意[15]。
脱去衣壳的PTV RNA在细胞内进行翻译，在3D聚合酶作用下，以(＋)RNA为模板，形成RNA复制中间型(replicateintermediate，RI)，先合成互补负链，再以负链RNA为模板合成正链。以新合成的正链RNA为模板，翻译合成一个大的融合蛋白，该多聚蛋白经过初级裂解形成L-P1-2A、2BC、P3等3种大的前体蛋白。次级裂解将L-Pl-2A裂解为L、VP0、VP3、VP1、2A；2BC最终裂解为2B、2C；P3最终裂解为3A、3B、3C、3D。次级裂解大多由3C来完成。最终，多聚蛋白被裂解为L、1A、1B、1C、1D、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D等成熟蛋白。P1-2A被3C蛋白酶裂解为VP0、VP1和VP3后，这3种蛋白组装成5S原体。5个5 S原体形成一个14 S五粒体，12个五粒体形成一个75 S的空衣壳。一部分新合成的(＋)RNA进入75S空衣壳，形成155 S的前病毒粒子，以后VP0裂解成VP2和VP4，形成成熟的160S的病毒粒子，新的病毒粒子装配完毕。装配完毕的PTV粒子最终随着细胞的死亡而被释放到胞外。
捷申病毒有2个AUG密码子，早期有人认为捷申病毒可以从第1个AUG起始翻译[4]。但实际上，除了5′非翻译区高度保守[12]外，PTV的第1个AUG并不保守。后来Kaku证实，捷申病毒毒株Talfan从第2个AUG412开始翻译[16]。
PTV的蛋白合成大约需要15 min，而RNA的复制只需要45 s。在病毒感染后3 min，细胞中即可测出5 S原体，7 min～10min可测出14 S五聚体，75 S空衣壳和150 S完整病毒颗粒在感染后20 min左右就可测出。整个复制过程见图1。
图1 PTV基因组及多聚蛋白裂解图
Fig.1 PTV genome and the ployprotein cleavage
5 捷申病毒的结构蛋白和非结构蛋白及其功能
5.1 猪捷申病毒结构蛋白
猪捷申病毒的衣壳由1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)4种结构蛋白各60分子组成，无囊膜。4种结构蛋白分别由74、279、242和262个氨基酸组成。不同的捷申病毒毒株，VP1蛋白的氨基酸数可能不同。VP1、VP2、VP3暴露在病毒粒子表面，其核心由高度保守的8条β链构成，VP4则埋于病毒粒子内部，与病毒基因组RNA核心结合，VP1蛋白大部分暴露在衣壳表面，是决定病毒抗原性的主要成分。Kaku预测了PTV衣壳结构，病毒的VP1GH-环、VP1C末端突起结构及VP2突起结构是病毒的主要抗原决定簇，能诱导中和抗体，可能共同直接参与了病毒-受体结合[5]，也正因此，LarosaG等[17]建立了基于VP1基因的捷申病毒和猪肠道病毒的RT-PCR鉴别诊断技术。在病毒脱衣壳的过程中，VP4的脱落伴随着VP1N末端从峡谷的底端内部跃迁到峡谷的外表面。脊髓灰质炎病毒VP1的突变能抑制脱壳：第8和第9个氨基酸缺失会影响RNA的释放，而第1到第4氨基酸缺失会影响到衣壳的组装。
5.2 捷申病毒非结构蛋白
迄今为止，P2和P3的具体功能还不清晰[18]，但ZellR等[19]报道PTV的P2和P3间无相互作用。猪捷申病毒的非结构蛋白包括L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D8种蛋白。其中2A蛋白是一种蛋白酶，主要进行捷申病毒2A/2B之间的裂解，2A蛋白酶参与P1-P2之间的Gln-Gly水解反应。和其他小RNA病毒不同，捷申病毒2A多肽以NPGP结尾，且活性不受eIF4G的切割影响，形态类似口疮病毒2A。随着小RNA病毒的进化2A蛋白的功能也趋于分化，在所有小RNA病毒中2A蛋白的功能并不一致[18]。2B能改变宿主细胞膜的通透性，2C对病毒粒子的组装很重要。脊髓灰质炎病毒2B和2C与病毒RNA的合成有关，2B可能与RNA的复制有关，2C与病毒的感染谱有关，2B和其前体2BC联合诱导细胞膜上的囊突形成，为病毒RNA的合成创造条件[20]。
3A参与抑制宿主主要组织相容性符合物I的表达，调节宿主细胞的免疫应答[21]。3B蛋白即VPg，可通过Try-OH以酯键共价结合到正链和负链5′端pUpU上，形成Vpg-pUpU结构。在FMDV中，3B可能具有RNA合成引物的作用，结合在新合成的正链5′端的Vpg的作用可能是一个包装信号。3C蛋白二聚体化，且和3CD及3D相互作用，但不和P2蛋白相互作用[19]。3C蛋白酶负责大部分多具蛋白的切割，包括L/1A、1B/1C、1C/1D、2B/2C、2C/3A、3B/3C、3C/3D[16]。3D具有聚合酶活性[18]，在该酶作用下以(＋)RNA为模板形成RNA复制中间型，先合成互补负链，再合成正链。笔者成功表达并对3D蛋白进行了生物学活性分析[22]，捷申病毒3D基因由1356个核苷酸组成，编码462个氨基酸，在PTV各毒株间高度保守，氨基酸同源性都在90%以上。3D蛋白作为病毒复制必须的RNA聚合酶，其高保守性是保证病毒遗传稳定性的必要条件，主要的催化作用包括：①Vpg的尿苷化；②RNA聚合酶；③末端腺苷转移酶。
尽管PTV非结构蛋白结构和功能还需进一步探索和证实，研究表明[18]，PTV和肠道病毒的非结构蛋白有如下相似之处：①2B、3A、3CD、3D同源二聚化；②2B与2BC和2C结合；③3C和3CD间有相互作用。
6 前景与展望
猪捷申病毒呈广泛的隐性感染，其对怀孕母猪、仔猪及免疫抑制猪的作用还不清楚，因此，有必要在我国进行猪捷申病毒的血清学及病原学的流行病学调查，尤其有必要探索其与其他病原体的相互作用及在继发感染中扮演的角色。同时，鉴于猪捷申病毒广泛隐性感染，同时与口蹄疫病毒等感染、复制、致病机理极为相似，笔者成功构建了捷申病毒的全长cDNA克隆，欲以此建立捷申病毒的反向遗传系统，若能以此为载体构建基因工程疫苗，将具有重要的意义。