鸡降钙素基因克隆及其真核表达质粒的构建

摘　要：采集日龄新扬州产蛋鸡腮后腺组织，直接提取总，进行反转录聚合酶链反应，扩增产物进行克隆、测序，获得新扬州鸡降钙素基因序列。测序表明，基因核苷酸长度为，编码个氨基酸。与上发表序列相比较，核苷酸同源性为，在第位处存在的有义突变。与从下载读取的红点鲑、大马哈鱼、河豚、斑马鱼、人、家鼠、绵羊、犬个物种序列进行比较分析，核苷酸同源性分别为、、、、、、及。将该基因片段克隆到真核表达载体，构建重组质粒，所获重组质粒经过酶切、测序鉴定，证实含有目的片段且连接、构建正确，为利用调控机体骨钙代谢、防治蛋鸡骨质疏松症的研究和应用奠定了基础。关键词：鸡；降钙素；基因克隆；表达载体

我国是世界蛋鸡养殖大国，近年来商品代蛋鸡占世界存栏量的40%～45%，且逐渐增加。2005年我国蛋鸡存栏20亿只，年人均鸡蛋占有量21.8kg，占世界第3位，是世界平均水平的2.1倍^[1]。伴随产业化进程的加快，笼养蛋鸡营养代谢病发病率也呈升高趋势，骨质疏松症便是其中一种。笼养蛋鸡骨质疏松症(Cage layerosteoporosis，CLO)又称为笼养蛋鸡疲劳症(Fatigue of cagelayers)，是蛋鸡养殖业中最严重的骨骼代谢疾病，发病率高达16%～30%^[2]，严重影响蛋鸡生产性能。如何调控蛋鸡钙磷代谢，预防CLO，延长笼养蛋鸡的产蛋周期，提高其产蛋性能是当前蛋鸡养殖业所面临的重要课题之一^[3-4]。传统营养学多采用适当提高日粮中钙、磷含量，调整钙磷比例和添加维生素D₃等方法防治CLO，但效果甚微。因此，通过调控产蛋鸡相关激素或因子水平调控蛋鸡钙、磷代谢，预防和治疗CLO是近年来营养和生理研究的一个重要内容^[5]。

降钙素(CT)是动物体内重要的钙调节激素，可促进骨骼再生，抑制破骨细胞活动，以减少骨钙入血，降低血钙浓度^[6]。其效应发挥是对受体内甲状旁腺素(PTH)的反馈抑制。二者始终保持动态平衡。人类医学领域已通过直接注射外源CT方式，调控钙、磷代谢，治疗骨质疏松^[7-9]。尽管这种方法有一定效果，但昂贵的成本、密集的注射频率使其难以推广于畜禽生产中。

由于肌肉注射外源DNA能在动物体内表达^[10-11]，如果将适量CT基因表达质粒在蛋鸡肌肉部位注射，使其不断表达产生CT，通过抑制破骨细胞活动，促进骨骼再生以有效防治CLO，将为人类开辟一条新的调控蛋鸡骨钙代谢和防治CLO的途径。与人类医学领域相比禽类CT研究起步较晚，国外学者较早克隆出鸡CT序列，但目前相关应用报道较少。国内关于鸡CT基因序列的克隆、测序及重组载体表达方面鲜有报道。本研究通过对新扬州鸡CT基因进行扩增及序列测定，并与其他动物的CT基因进行比较，构建真核表达质粒。这为进一步研究鸡PTH在蛋鸡体内的高效表达，并通过质粒接种等基因手段防治CLO的研究提供了可能。

1　材料与方法

1.1　组织材料

组织样品采自扬州大学试验农牧场的200日龄新扬州产蛋鸡。放血宰杀后取腮后腺组织，清洗干净后立即提取总RNA。

1.2　菌种和质粒

JM109感受态大肠埃希菌由扬州大学畜牧兽医学院传染病实验室馈赠。pGEM-T Easy VectorSystem购自美国Promega公司。pCEP4真核表达载体购自Invitrogen公司。DH5α感受态大肠埃希菌由扬州大学畜牧兽医学院转基因动物研究中心制备、保存。

1.3　酶类和主要试剂

HindⅢ、BamHⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶及DNAMarker均购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR产物凝胶回收试剂盒为杭州维特洁生化技术有限公司产品。X-gal、RT-PCR试剂盒、DNA纯化试剂盒购自美国Promega公司。异丙基硫代D-半乳糖苷(IPTG)、焦碳酸二乙酯(DEPC)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。其他试剂为国产分析纯。

1.4　方法

1.4.1　RT-PCR引物设计与合成　应用DNA Star(Version 6.0)基因分析软件Primerselect模块，参照GenBank(X03012)^[12]上发表的鸡腮后腺组织基因的碱基序列设计1对引物，并且在上游引物的5′端插入1个HindⅢ酶切位点，在下游引物的5′端插入1个BamHⅠ酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物：5′-CGAAGCTTATGGTCATGCTGAAGATTTCATC-3′；下游引物：5′-TAGGATCCCTAGTTGTTTCCTAGGGTTTCC- 3′。

1.4.2　鸡腮后腺组织总RNA提取　用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法纯化组织和细胞中的RNA，提取鸡腮后腺组织总RNA^[13]。取5 μL分别测定260 nm和280 nm的吸光度(OD)，计算总RNA的量，以OD₂₆₀/OD₂₈₀值判定RNA纯度。另取5 μL经甲醛变性后，进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，其余的于－70 ℃保存备用。

1.4.3　鸡CT基因RT-PCR扩增　RT-PCR按照Access RT-PCR IntroductorySystem说明书进行。采用50 μL反应体系：DEPC 28 μL,5×RT-PCR buffer缓冲液10 μL，MgSO₄(25 mmol/L)2 μL，dNTPs(每种浓度为10 mmol/L)1 μL，上游引物(50pmol/μL)1μL；下游引物(50 pmol/μL)1 μL，吹打混匀，加入逆转录酶1 μL，DNA聚合酶1 μL，混匀后加入模板RNA 5μL。反应程序：48 ℃ 45 min；94 ℃2 min；94 ℃30 s，60 ℃1 min，68 ℃2min,40个循环；68℃7 min。同时设立无模板的阴性对照。反应结束后，取5 μL PCR产物用10g/L的琼脂糖凝胶进行电泳分析，染色后于紫外灯下检测拍照。

1.4.4　鸡CT基因克隆及鉴定　将PCR产物按DNA纯化试剂盒说明书纯化后与商品化载体pGEM-T连接，室温作用1h后，再将连接产物转化JM109感受态细胞，取200 μL涂布于含100 μg/mLAmp(氨苄青霉素)和X-gal、IPTG的LB平板上，37 ℃恒温箱中培养16 h后，挑取单个白色菌落接种于加Amp (100μg/mL)的液体LB培养基中，37 ℃恒温培养12 h～16 h。按照文献[13]提取重组质粒，然后分别进行PCR和用Hind和BamHⅠ 2种限制性内切酶做双酶切电泳检测。将初步确定为阳性克隆的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

1.4.5　鸡CT基因重组表达载体的构建　用HindⅢ和BamHⅠ将CT片段释出，定向克隆到同样处理的pCEP4载体中，构建重组表达质粒pCEP4-CT。再将连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有Amp的LB琼脂平板培养基上培养16h，挑取单个白色菌落接种于加Amp (100 μg/mL)的液体LB培养基中，37 ℃恒温培养12 h～16h。按照文献[13]提取重组质粒，进行PCR及酶切电泳检测。选择酶切和PCR鉴定为重组阳性的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，验证重组质粒读码框的正确性。

1.4.6　序列分析　采用DNA Star(Version6.0)软件的MegAlign模块，将新扬州鸡CT基因(GenBank收录号：EU367492)与鸡(X03012)、人(M26095.1)、绵羊(M98053.1)、犬(AJ271090.1)、家鼠(X97991.1)、河豚(AJ309015)、红点鲑(AF497758.1)、大马哈鱼(Y00765)、斑马鱼(AF026271)9个物种的CT基因序列进行比较，分析不同物种之间的相似率和分歧率，以此作为不同序列之间的同源性比较的依据。

2　结果

2.1　鸡CT基因RT-PCR扩增

取5 μL PCR产物与2 μL上样缓冲液(溴酚蓝)混合后，在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，可见在250bp～500bp之间有1条特异性亮带，与预期的417 bp相符(图1)，说明本试验设计的PCR引物及反应条件具有较好的特异性。

2.2　鸡CT基因的克隆及鉴定

将鸡CT基因的RT-PCR产物经纯化回收后，插入到pGEM-T载体的外源基因插入位点，构建重组质粒，转化JM109后挑选白色菌落扩培后，提取重组质粒再进行PCR电泳，出现一条长约417bp的特异性条带；经HindⅢ＋BamHⅠ酶切电泳出现两条带，其中一条为质粒载体，约3 000 bp，另一条带为所克隆的鸡CT基因片段，约417 bp(图2)。

M.DNA标准DL 2 000；1.RT-PCR产物

M.DNA Marker DL 2 000；1.RT-PCR products　

图1　RT- PCR产物的鉴定

Fig.1　Electrophoresis of PCR products

1.λ-EcoT14Ⅰ酶切；2.阴性对照；3.重组质粒双酶切；4.重组质粒PCR产物；5.DNA标准DL 2000

1.λ-EcoT14Ⅰ digest；2.Negative control；3.Recombinant plasmid by digested (HindⅢ＋BamHⅠ)；4.Recombinant plasmid PCR products；5.DNA Marker DL 2 000 (HindⅢ＋BamHⅠ) and PCR

图2　重组质粒PCR和酶切鉴定图

Fig.2　Identification of recombinant plasmid by enzymic digestion

2.3　鸡CT基因序列测定及分析

选择酶切和PCR鉴定为CT基因重组阳性的质粒进行正反两个方向的序列测定，报告的核苷酸序列经分析去除两端引物中的多余碱基，得到全长417bp的核苷酸序列，与GenBank(X03012)^[12]上发表的CT基因，同源性为99.8%，在阅读框内仅相差1个碱基，即135处的G转换成了C，相应的引起了氨基酸的变化，第45位的谷氨酸转变为天冬氨酸(图3中标红色且加下划线处)。

2.4　种属间CT基因序列比较

将鸡CT序列与其他8个物种相比较(表1)，鸡与红点鲑同源性略高，保持在74.0%，而与大马哈鱼、河豚、斑马鱼、人、家鼠、绵羊、犬同源性较低，分别为63.5%、60.0%、55.8%、53.1%、51.1%、48.2%及42.5%；鱼类动物间CT同源性较高，保持在70.0%～99.0%之间；哺乳动物中，绵羊与犬CT同源性较高，为70.0%。

由各物种CT基因进化树(图4)可见，哺乳动物和鱼类亲源性较远，哺乳动物中，犬和绵羊间亲源性较近，鱼类间同源性较高。

2.5　鸡CT重组表达质粒的构建

将鸡CT基因的PCR回收产物与pCEP4表达载体同时进行HindⅢ和BamHⅠ双酶切，纯化回收后构建质粒，转化DH5α感受态细胞，提取重组质粒进行PCR反应及电泳分析，出现一条长约417bp的特异性条带；重组质粒经HindⅢ酶切后电泳分析，结果出现一条大小约10.6 kb的带；经HindⅢ＋BamHⅠ双酶切后电泳分析结果出现两条带，其中一条带为载体质粒，约10.2 kb；另一条带为所克隆的PTH基因，约417bp(图5)。测序结果表明该转化菌的质粒中确实含有目的基因片段，且读码框正确。

图3　核苷酸序列及其编码的氨基酸

Fig.3　The nucleotide sequence and deduced amino acids

表1　不同种属动物CT基因序列同源性比较

Table 1　The homology of CT gene among different animals

注：对角线以上为相似率，对角线以下为分歧率。

Note：Percent similarity in upper triangle，percent divergence inlower triangle.

图4　不同种属动物CT基因系统进化树

Fig.4　Phylogenetic tree of CT of different animals

1.λ-EcoT14Ⅰ digest；2.阴性对照；3.重组质粒双酶切；4.重组质粒PCR产物；5.DNA标准DL 2 000

1.λ-EcoT14Ⅰ digest；2.Negative control；3.Recombinant plasmid by enzymitdigestion(HindⅢ＋BamHⅠ)；4：Recombinant plasmid PCR production；5.DNA Marker DL 2 000

图5　重组质粒PCR和酶切鉴定图

Fig.5　Identification of recombinant plasmid by digested (HindⅢ＋BamHⅠ) and PCR

3　讨论

CLO以蛋鸡骨量减少和骨微结构退化为特征，PTH和CT是与骨代谢密切相关的钙调节激素。PTH分泌增加，破骨细胞活性增强，骨吸收加剧，溶解更多的骨钙入血，提高血钙浓度。CT生理作用与PTH相反，它能降低血液中的钙浓度，抑制破骨细胞生长，促进骨再生^[14]。二者始终处于偶联与解偶联状态。因此，CT是调控骨钙代谢，防治骨质疏松的重要物质。

从新扬州鸡腮后腺组织中克隆的CT基因，与GenBank已发表鸡CT基因序列进行比较，发现存在一个碱基变异，且导致氨基酸变异，说明鸡CT基因具有一定多态性。将鸡CT基因与人和其他动物进行比较，发现鱼类动物间CT同源性较高，哺乳动物中仅绵羊和犬CT同源性较高，CT在不同种属动物之间同源性较低。

CLO是笼养蛋鸡重要的骨骼疾病之一，该病一年四季均可发生，且多发生于高产鸡群的产蛋高峰期。传统的营养学对于CLO的防治多是从营养生理角度考虑，多数采用适当提高日粮中钙、磷含量，调整钙磷比例和添加维生素D₃等方法。但充足营养供给时，产蛋高峰期仍有部分蛋鸡出现骨质疏松症状，这说明影响CLO发病的因素较多，除了食物因素外，蛋鸡体内存在的众多激素及细胞因子对骨钙代谢过程也发挥着极为重要的调节作用。因此，单纯从营养供给量及营养物质关系角度出发调控蛋鸡骨钙代谢，并不能有效防止CLO的发生。除寻求良好的钙磷补充方式外，提高机体骨钙沉积、骨重建能力亦是防治CLO的方法之一。人类临床医学中除“食补”疗法外，主要采用药物注射方式调节体内CT分泌，进而完成对机体骨钙代谢的调控，促进骨重建。但昂贵的成本、密集的注射频率使其难以推广至畜禽生产中。

因此，选择合适的方法和剂量将pCEP4-CT转入蛋鸡体内，使其在机体内获得高效表达，通过定期分析鸡体内各种相关激素(因子)以及骨骼形成质量等与钙代谢相关的生理生化指标，进而研究提高鸡骨骼沉积能力的可能性，并为防治CLO及禽类钙营养代谢相关疾病提供有效途径，这也将为进一步推广至其他动物的应用研究提供参考依据。