摘 要：为了研究和开发理想的大肠埃希菌多重耐药抑制剂，用连翘作用于多重耐药大肠埃希菌，提取其基因组DNA，并以大肠埃希菌AcrA基因的编码序列设计引物，成功扩增出AcrA基因中1005bp的片段，与多重耐药菌种中的AcrA基因序列进行对比。结果表明，连翘改变AcrA基因的编码序列，并能有效抑制多重耐药大肠埃希菌的生长，减弱其耐药性
关键词：连翘；大肠埃希菌；多重耐药；AcrA基因
大肠埃希菌产生多重耐药性主要与AcrAB外排系统有关[1-3]，该系统能够主动将扩散进细菌细胞中的抗菌药物泵出细胞外，从而使细菌获得耐药性，如果使该系统失活，则菌株即从多重耐药状态转变为敏感状态。因此，多重耐药抑制剂的研究和开发是解决大肠埃希菌多重耐药问题的重要途径[4-5]。目前多重耐药抑制剂的研究和开发主要集中在抗生素方面，但抗生素从一问世就面临耐药的威胁，尤为突出的是，当细菌接触某种抗生素时，可产生对多种结构不相关抗生素的多重耐药，因而给抑制剂的开发带来一定的困难[6-8]。然而，有些中药具有一定抗菌抗病毒的作用，并且中药具有价格低廉、不易产生耐药性等优点，可以克服抗生素产生的诸多弊端，可作为新型的多重耐药抑制剂进行开发研究[9]。
本试验用中药连翘作用于多重耐药大肠埃希菌，并对AcrA基因进行了分子生物学研究，为进一步探讨中药对多重耐药性作用机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 菌种
多重耐药大肠埃希菌株，由延边大学农学院药理室提供。
1.2 药品
标准DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs、溶菌酶、蛋白酶K，均购自北京基因组研究所；PCR引物由上海英骏生物技术公司合成；大肠埃希菌株基因组DNA提取试剂盒和PCR产物纯化试剂盒，购自上海英骏生物技术公司；中药连翘，采用水煎法制得药液后干燥浓缩成干粉放入干燥器中备用
1.3 仪器
数码凝胶图像分析系统GDS-800，PCR仪9700，水平电泳槽JYDF，台式高速离心机，超净工作台。
1.4 方法
1.4.1 连翘亚抑菌浓度测定 首先将连翘干粉用灭菌的双蒸水溶解，配制成浓度为640 mg/mL的原始药液，分装，置－20℃冰箱保存备用。
最小抑菌浓度(MIC)测定：试验时用LB培养基对原始药液采用试管2倍稀释法进行稀释，最终稀释的浓度分别为64、32、16、8、4、2、1mg/mL。每个试验重复3次，每次设3个对照组：菌液对照为接种同数量的多重耐药菌液，不加连翘；培养基对照为不接种多重耐药菌液，不加连翘；药物对照不加菌液只加适量连翘。37℃培养18 h，确定亚抑菌浓度[10-11]。
1.4.2 大肠埃希菌基因组DNA的提取[12]培养5 mL大肠埃希菌培养物至饱和状态，取1.5 mL的培养物离心2 min。具体提取方法按试剂盒步骤进行。
1.4.3 大肠埃希菌AcrA基因扩增 从GenBank中查到大肠埃希菌AcrA基因序列借助计算机软件设计引物，引物由上海英骏生物有限公司合成。上游引物为：5′GACGACAAACAGGCCCAACA3′，下游引物为：5′TTAAGACTTGGACTGTTCA3′。将大肠埃希菌基因组作为模板，反应体系为50μL。灭菌双蒸水30 μL,10×buffer反应缓冲液5 μL，5 mmol/L dNTPs 4 μL,10μmol/L引物各1μL，1.5 UTaqDNA聚合酶1 μL，DNA模板8 μL，PCR循环参数为94 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 60s,30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
1.4.4 AcrA基因PCR产物序列分析 由上海生工生物工程技术服务有限公司测序完成。
2 结果
2.1 连翘亚抑菌浓度测定结果
中药连翘的亚抑菌浓度为32 mg/mL。
2.2 连翘作用后的ArcA基因PCR产物结果
PCR扩增后，对其产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在1 105 bp处出现明显的特异性条带(图1)。
2.3 连翘作用前后的ArcA基因序列测定结果对比
连翘作用前后ArcA基因序列测定结果见图2，其中每对序列的前1条为作用前，后1条为作用后，
加下划线的为中药连翘作用后的突变基因。
1.PCR扩增产物；M.DL 2 000 Marker
1.PCR amplification products；M.DL 2 000 Marker
图1 ArcA加入连翘后PCR产物的琼脂糖电泳图
Fig.1 Agarose electropherogram of PCR product of ArcA added intoextract offorsythiasuspensa
图2 AcrA序列测定结果对比分析
Fig.2 Comparison and analysis of AcrA sequencing rssults
由图2可以看出，在连翘作用后的560 bp～720 bp序列之间，突变碱基占多数，其他部位基本无突变。
3 讨论
通过对连翘作用后多重耐药大肠埃希菌AcrA基因产物的序列分析，可以看出，连翘作用后多重耐药大肠埃希菌AcrA基因发生了24个碱基突变，说明中药连翘能够改变大肠埃希菌AcrA外排系统的结构。
本试验选用中药连翘对AcrA基因进行作用，因为连翘粉末属于粗提，对试验过程中的亚抑菌浓度测定及基因组DNA的提取可能会有一定的影响。
研究表明，抑制AcrAB外排系统的活性或改变其结构以及降低其表达水平，都可使大肠埃希菌对环境的适应能力及抗生素耐药水平下降。在本试验中连翘主要是通过改变AcrAB外排系统的结构而起到抑菌作用，至于连翘是否通过抑制AcrAB外排系统的活性或降低其表达水平而起到抑菌作用，还有待进一步研究。
虽然已证实了大肠埃希菌的多重耐药性主要与AcrAB外排系统有关，但菌体细胞膜通透性的改变与主动外排系统的超量表达共同作用，可引起细菌对多重抗生素高频率、高水平的耐药，而耐药性质粒的存在可能使多重耐药水平提高数倍[13-14]。至于这些过程的相互作用机理，以及连翘是否也通过调节这些作用过程而起到抑菌作用，有待进一步研究。