摘 要：参考GenBank上的IBV S1基因序列，自行设计合成了一对跨幅约0.6kb的引物，RT-PCR对6株IBV分离株的S1基因进行扩增。序列分析显示，这些病毒从时间、空间和组织嗜性都没有明显的规律可循。2株从传染性腺胃炎病鸡中获得病毒(ZC4-3株和DB239-1株)属于既不同于国内其他分离毒株，又不同于国际参考毒株的独立一群。通过对IBV的分析，认为现流行的IBV已发生了很大的变异，分别利用嗜肾性、嗜呼吸道性和嗜腺胃性的毒株研制疫苗，对我国IBV的防疫十分重要。
关键词：传染性支气管炎病毒；S1基因；序列；进化关系
传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitisvirus，IBV)是冠状病毒科最早发现的成员，也是冠状病毒科的代表种。冠状病毒为ssRNA、有囊膜的病毒。冠状病毒科有2个属，即冠状病毒属(Coronavirus)和凸隆病毒属(Torovirus)[1]，IBV与火鸡蓝冠病病毒(Blue comb disease virus ofturkeys)和至少其他9种哺乳动物的冠状病毒同属冠状病毒属的成员。禽的冠状病毒主要为传染性支气管炎病毒及火鸡蓝冠病病毒，而火鸡蓝冠病病毒只感染火鸡，并不感染鸡[2]。此外，还从表现矮小综合征的病鸡中分离到很象小冠状病毒的病毒颗粒，称为类冠状病毒颗粒[3]。IBV以高度易变、难以预防、经济损失严重等特点使得世界各国对它的研究一直很重视[4]。
IBV含有3种主要的病毒特异蛋白，纤突蛋白(S)，膜蛋白(M)和内部的核蛋白(N)。病毒中和抗体和HI抗体由表面的大突起，即纤突蛋白S诱导产生的，它是病毒粒子的最外层成分[5-6]。S由S1和S2两个亚单位组成。Koch用单克隆抗体揭示S1上有3个部位，一个部位可产生病毒中和抗体和血凝抑制抗体，另一个部位产生中和抗体，第3个部位不产生任何一种抗体，但可产生交叉反应[7]。检测S1基因的序列有助于IBV血清型的分类[8]。鸡IBV不同的血清型、亚型和变异株的产生通常认为是由病毒核酸的点突变、插入、缺失或RNA重组引起的[9]。这种变化在对S1基因的分析上尤其明
显[10]。因此，为了在分子水平上研究IBV的血清型变异，对S1基因的序列进行比较是有用的。
本研究应用S1基因的一对引物，对6株从病鸡中分离获得的病毒进行了RT-PCR和序列测定分析，以探索这些病毒的变异情况和病毒来源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒 IBV标准毒株M41株由澳兰百特生物公司惠赠。
1.1.2 主要试剂与工具酶 TaqDNA聚合酶、MgCl2、反转录酶M-MLV RT、Rasin、dNTP和DNA标准DL 2 000为宝生物工程(大连)有限公司产品。
1.1.3 引物 利用Primer 5.0软件，参照GenBank上发表的IBV S基因序列，设计了一对跨幅约0.6kb的引物。该区段包含了S1基因C末端的1 097～1697的片断。引物序列如下，S1：5′-CATAACTAACATAAGGGCAA 3′；S2：5′-TGGTCCTCTTCAAGGTG3′。
1.1.4 主要溶液的配制 所有接触RNA的试剂及器皿均需无Rnase污染，玻璃容器在烘箱中160 ℃干烤2 h以上。塑料制品用1mL/L的DEPC水溶液浸泡处理，121 ℃灭菌30 min，除去残余的DEPE。所用试剂一律用1mL/L的DEPC水溶液配制，并高压灭菌。
5×TBE缓冲液的配制：每升溶液含54 g Tris碱，27.5 g硼酸，20 mL 0.5 mol/L的EDTA(pH8.0)。电泳工作液为0.5×TBE(将以上溶液｀10倍稀释)。
1.1.5 IBV毒株来源 DB2是2007年10月从东北地区某鸡场病鸡尿囊液中分离，D-4和D-2是2007年7月从山东青岛某鸡场病鸡腺胃中分离，ZC4-3是2007年5月分离自山东诸城某鸡场病鸡的腺胃，QD05-1是2007年4月分离自山东青岛某鸡场病鸡的肺气管。DB239-1是2008年1月分离自东北某鸡场病鸡的腺胃。
1.2 方法
1.2.1 病毒的分离与培养 将上述病毒用灭菌生理盐水作1∶50倍稀释，经尿囊腔接种于9日龄～11日龄SPF鸡胚，剂量为0.2mL/胚，置37 ℃继续孵化，弃去接种后24 h内死亡鸡胚。收集接种后培养36 h～48 h的鸡胚尿囊液，置－20 ℃备用。
1.2.2 病毒核酸的提取 取病毒尿囊液，反复冻融3次，5 000 r/min离心30 min。弃沉淀，取上清400 μL，加600μL裂解液，颠倒混匀，加450 μL氯仿，振荡，－20 ℃沉淀10 min,13 000 r/min离心10 min。取上清650μL，加800 μL异丙醇，颠倒混匀，－20 ℃沉淀1 h。13 000 r/min离心10 min，弃上清，用750mL/L的冷乙醇冲洗1次，用吹风机将核酸吹干，待用。
1.2.3 反转录流程 反转录过程(采用20 μL体系)，RT专用水11 μL，buffer 4 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，M-MLV(200 U/μL) 1 μL，Rnasin(40 U/μL) 0.5 μL，Pa＋Pb(50 pmol/μL)0.75μL＋0.75 μL。用以上体系溶解核酸，将反转录体系置于水浴锅中42 ℃作用1 h。
1.2.4 聚合酶链反应(PCR) PCR扩增(采用30 μL体系)，ddH2O 17 μL，buffer 3 μL，MgCl2(25 mmol/L) 4 μL，dNTP(2.5mmol/L)2.5 μL，Taq酶0.5 μL，Pa＋Pb(50 pmol/μL) 0.5μL＋0.5 μL，模板(即反转录产物)2 μL，进行PCR：94.5 ℃2 min；94.5 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 60 s,30个循环；72 ℃延伸9 min。
1.2.5 PCR产物检测 PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶，5 V/cm直流稳压电泳45 min。紫外透射分析仪观察，照相记录。
1.2.6 PCR产物的纯化 按宝生物工程(大连)有限公司的Agarose Gel DNA Purification Kit ver2.0说明书进行，具体步骤如下：切下含DNA的琼脂糖块，使其尽可能小，放入1.5mL离心管中。称量胶块重量，计算胶块体积，计算体积时，以1 mg＝1 μL进行计算。向胶块中加入3个凝胶体积量的胶块溶化液DR-Ⅰbuffer。混匀后，75 ℃加热溶化胶块，间断震荡混合，使胶块充分溶化。向上述溶化液中加入DR-Ⅰbuffer量的1/2体积量的DR-Ⅱ buffer，均匀。将试剂盒中的Spin Column置于CollectionTube上，将上述溶液转至Spin Column中，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。将500 μL的RinseA加入Spin Column中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液。将700 μL的Rinse B加入SpinColumn中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液。重复最后一步。将Spin Column置于新的1.5mL的离心管，在Spin Column膜中央处加入25 μL的Elution buffer。室温静置1 min。12 000r/min离心1 min，洗脱DNA。
1.2.7 连接反应 将纯化产物与T-载体连接，灭菌的0.2 mL薄壁管加入纯化产物4 μL，pMD18-T载体1 μL，溶液Ⅰ5μL，轻轻吹打均匀，于4 ℃下过夜连接。
1.2.8 转化 将感受态细胞从－70 ℃冰箱中取出，在冰盆中冰浴，加入10 μL连接反应液，冰浴30 min。在42℃水浴中热激90 s，冰浴2 min～3 min，迅速加入不含氨苄的LB培养基至终体积1 mL，于37 ℃摇床中，160r/min摇1 h。取1个含Amp的平皿，将混合好的IPTG 10 μL和X-Gal 50μL均匀的涂布于平皿上，待完全吸收。将转化的菌液8 000 r/min，离心3 min，弃上清至剩余200 μL，将菌体悬浮200μL全部涂布于LB平皿上，37 ℃培养过夜。挑取圆滑的白色菌落提取质粒。
1.2.9 质粒鉴定 将3 mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15mL的试管中，接入1个单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。取1.5 mL培养物加入1.5 mL离心管中，于4 ℃，12 000r/min离心5 min，吸尽培养液。将细菌沉淀重悬于100μL预冷的溶液Ⅰ(50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/LTris-HCl pH 8.0，10 mmol/L EDTA)中，剧烈振荡。加200 μL新配制的溶液Ⅱ(0.2 mol/LNaOH,10 mL/L SDS)，缓和振荡，冰浴5 min。加150 μL预冷溶液Ⅲ(50 mol/L KAc 60mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL)，缓和振荡，冰浴5 min。于4 ℃，12 000 r/min离心5min，将上清转移到另一离心管中。加等量饱和酚-氯仿，振荡混匀，4 ℃以12 000 r/min离心5min。用2倍体积无水乙醇沉淀双链DNA，振荡混合，于－20 ℃放置30 min。4 ℃ 12 000 r/min离心10min。用750 mL/L乙醇于4 ℃洗涤DNA，将离心管倒置于1张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。加20 μL的1×TE(含20μg/mL无DNA酶的胰RNA酶)，振荡，取少量进行PCR鉴定。
1.2.10 测序 由宝生物工程(大连)有限公司完成。
2 结果
2.1 不同毒株的S1基因扩增结果
不用毒株的S1基因扩增结果见图1。
2.2 IBV各分离株部分S基因系列进化树
IBV分离株与GenBank中的参考毒株基因序列发生进化树和序列相似性百分比分析，见图2和图3。
1.DB2-3；2.D-2；3.D-4；4.ZC4-3；5.QD05-1；
M.DNA标准DL 2 000；6.DB239-1
1. DB2-3；2.D-2；3.D-4；4.ZC4-3；5.QD05-1；
M.DNA Marker DL 2 000；6. DB239-1
图1 各分离株的S基因RT-PCR
Fig.1 RT-PCR of the isolates S gene
图2 IBV各分离株S基因系列进化树
Fig.2 Phylogenetic tree for S gene of IBV isolates
图3 IBV分离株与GenBank中的参考毒株基因序列相似性分析
Fig.3 Sequence distance analysis for S gene of IBV isolates and IBVreference sequence in GenBank
此6株分离株和9个参考毒株进行综合分析，它们的同源性最高可达99.8%，最低59.8%，遗传距离在0.2%～28.7%之间。其中ZC4-3和DB239-1与其他毒株的遗传距离较远。
3 讨论
由于IBV变异性强，因此引物的设计必须在基因的高度保守区内进行，以便能获得1对能广泛应用于所有IBV的通用引物。但为了能对分离的病毒进行分类，又必须选择能代表病毒基因变异的区域进行研究，S蛋白基因被很多科学家当作IBV分型的主要研究对象。
从临床上表现典型临床症状的病鸡组织中分离到6株病毒，其中ZC4-3株和DB239-1株与其他毒株的同源性较低，说明我国流行的IBV与疫苗毒株和国际上许多毒株发生了明显的变异。不论是从组织嗜性、分离时间、发病鸡品种和地理上看，这些病毒并没有表现出明显地规律性变化。ZC4-3株和DB239-1株又属于与所有其他分离毒株不同的一群。
IBV不断发生变异，给由IBV引起的传染性支气管炎的诊断和预防带来了严重的困难，快速、及时地对所分离的IBV进行分析和研究，对于IBV的防疫十分重要。