摘 要：利用纯化的猪戊型肝炎病毒(HEV) ORF2-M1重组蛋白免疫Balb/c小鼠，采用杂交瘤细胞技术，获得了2株稳定分泌抗HEVORF2-M1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为BC4和2A10。经ELISA测定，2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1.60×103和1∶0.80×103，接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗均能特异性识别重组ORF2-M1蛋白，但它们识别ORF2-M1蛋白的不同表位。间接免疫荧光试验证实，2株单抗具有良好的特异性，均能够识
关键词：戊型肝炎病毒；ORF2-M1蛋白；单克隆抗体；猪
猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是一种无包膜的正链RNA病毒，直径27 nm～32nm，表面粗糙，呈不规则球型。HEV基因组全长大约为7.5kb，具有3个互相重叠的开放阅读框，即ORF1、ORF2和ORF3。ORF2起于第5 107位核苷酸，延伸1 980bp，终止于Poly(A)上游63个核苷酸，长约2kb，编码病毒衣壳蛋白，为主要的结构基因编码区。该病毒主要经粪、口途径传播，常引起戊型肝炎暴发或散发。戊型肝炎广泛流行于亚、非及美洲的一些国家，呈全球性分布，主要侵害青壮年，其中孕妇死亡率高达20%[1]。我国是戊型肝炎流行的主要地区之一，戊型肝炎发病率约占临床散发型肝炎的15%～20%。1997年，Meng等发现猪群中存在着与美国人戊型肝炎病毒基因组高度相似的病毒[1]，从此对猪戊型肝炎病毒人兽共患的研究在许多国家开展起来[2-4]。由于缺乏有效的病毒体外长期培养系统，阻碍了戊型肝炎病毒疫苗的研制和诊断试剂的开发。用基因工程手段表达HEV主要结构蛋白已成为研究的热点。本文报道用原核表达系统表达含HEV主要抗原表位的ORF2-M1蛋白，并以其为免疫原制备抗ORF2-M1的单克隆抗体(McAb)，单克隆抗体由于具有特异性强、均质性高、易于标准化以及可批量生产等特点，已在生物医学领域得到了广泛的应用。本试验研制抗Ⅳ型HEV的单克隆抗体，旨在为Ⅳ型HEV的诊断提供敏感、特异、稳定的诊断试剂，并为ORF2蛋白抗原表位的精确定位以及基于表位的基因工程疫苗研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 HAT、HT选择培养基、HRP-羊抗鼠IgG、FITC标记羊抗鼠IgG、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂均为Sigma公司产品；PEG(MW,3350)为Solarbio公司产品；国产优级胎牛血清购自天津颧洋生物工程公司；所用其他化学试剂均为分析纯。
1.1.2 细胞 A549细胞、SP2/0骨髓瘤细胞均为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室冻存。
1.1.3 小鼠 雌性Balb/c小鼠和昆明鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
1.1.4 病料的阳性血清 感染猪戊型肝炎病毒株猪的胆汁由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室分离保存。HEV阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点室保存。
1.2 方法
1.2.1 间接ELISA检测方法的建立 采用方阵滴定法确定间接ELISA所用包被抗原和抗体的最适工作浓度。将纯化的ORF2-M1抗原、Balb/c小鼠阳性血清和阴性血清均作倍比稀释，同时设立SP2/0细胞培养上清及空白对照，选择以阳性血清孔的OD492值接近1.0，P/N>2.1时的抗原、血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度。
1.2.2 间接免疫荧光检测方法的建立 用感染Ⅳ型HEV猪的胆汁，按1∶10倍稀释感染A549细胞，同时以正常细胞作为阴性对照，无水乙醇固定细胞，自然干燥后加入Balb/c小鼠阳性血清、阴性血清、SP2/0细胞培养上清及待检杂交瘤细胞上清，37℃孵育40 min，PBS洗涤后加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，37 ℃孵育40 min，PBS洗涤后荧光显微镜下观察结果。
1.2.3 小鼠免疫及检测 用电洗脱方法纯化ORF2-M1蛋白，加等体积完全弗氏佐剂，充分混匀后经背皮下和后腿肌肉注射6周龄Balb/c小鼠，每只100μg；2周后进行第2次免疫，方法与首免相同；间隔2周后，以不加佐剂的等量抗原进行第3次免疫。3周后采取尾静脉和腹腔注射相结合的免疫方式进行加强免疫，注射半量抗原，3d～4 d后采血，用间接ELISA测定血清效价，效价达到1∶104以上即可取脾进行细胞融合[3-4]。
1.2.4 细胞融合 加强免疫后3d摘除眼球放血处死小鼠，收集血液，分离血清作为ELISA检测的阳性对照。无菌操作取其免疫脾细胞，在PEG3350作用下与骨髓瘤细胞SP2/0以10∶1的比例融合，加入已制备有饲养细胞的96孔板，以含200mL/L小牛血清的HAT培养液，置37 ℃体积分数为5%CO2培养箱中培养。待杂交瘤细胞长至孔底面积1/3～2/3时，取培养上清用间接ELISA方法检测抗体，阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆[5]。
1.2.5 单克隆抗体腹水的制备 取10周～12周龄Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL，1周后，每只小鼠腹腔注射5×105个杂交瘤细胞，7 d～10 d后，小鼠腹腔明显隆起，采集腹水，10 000 r/min离心10min，去除油脂沉淀，吸取上清，ELISA检测其效价，－70 ℃保存[6]。
1.2.6 杂交瘤细胞染色体检查 培养2 d～3 d，杂交瘤细胞和SP2/0细胞分别加入秋水仙素使其终浓度为0.1μg/mL，继续培养2.5 h，离心，收集细胞，用10 mL 0.075 mol/L KCl溶液重悬，于37 ℃水浴低渗处理30min，加入1 mL细胞固定液(3份甲醇＋1份冰醋酸)预固定2 min～3 min，1 000 r/min离心5min，弃上清。细胞用新鲜固定液在室温固定2 min，重复固定一次。加入1mL固定液制成悬液，垂滴1滴～2滴至洁净冷冻的载玻片上，自然干燥。用Giemsa染色液染色10min，蒸馏水冲洗晾干。在显微镜下观察染色体的形态，分别计数10个形态完整、单在、染色体分散良好、无重叠、无散失的细胞进行观察、染色体记数分析[7]，计算出平均染色体数目。
1.2.7 单克隆抗体饱和值的测定 将2株单克隆抗体从1∶1000开始做倍比稀释，分别加入包被有最适浓度抗原的96孔酶标板，同时设阳性、阴性血清对照，以单抗OD490值明显降低的临界点为单抗饱和浓度值。
1.2.8 单克隆抗体抗原识别位点的分析 采用测相加指数法，以最适浓度抗原包被酶标板，洗涤后分别加入饱和浓度的单抗，每株16孔，37℃孵育1 h，洗涤后每株取其中8孔分别加入HRP-羊抗鼠IgG,37 ℃孵育1h，洗涤后显色，测定OD值。然后在剩余的8孔中分别加入另一株单抗，37 ℃孵育1 h，洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG,37 ℃孵育1h，洗涤后显色，分别测定OD490值。按下列公式计算2株单克隆抗体叠加后的AI值。
AI＝(A1.2-A1)/A2×100%，A1.2表示2株单抗叠加后的OD490值；A1表示第1株单抗的OD490值；A2表示第2株单抗的OD490值。当两两抗体叠加的AI值大于10%时，表明这2种抗体所识别的抗原位点不同，当两两抗体叠加的AI值小于或等于10%时，表明这2种抗体所识别的抗原位点相近或相同[8]。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立
用所免疫的ORF2-M1重组蛋白包被酶标反应板，pet-32a包被酶标反应板作为对照。采用间接ELISA法检测，OPD底物显色，测定A吸光度值，P/N≥2.1者为ELISA阳性。杂交瘤筛选时，凡ORF2-M1阳性，同时pet-32a阴性者，为McAb阳
性孔。阳性孔用有限稀释法亚克隆2次～3次，至100%培养孔阳性，即建立分泌McAb的杂交瘤细胞株。采用制备腹水和培养瓶直立培养法大量制备McAbs。获得2株阳性杂交瘤细胞，分别命名为BC4和2A10。
2.2 杂交瘤细胞培养上清及腹水效价的测定
将杂交瘤细胞培养上清和腹水分别进行系列稀释，然后用间接ELISA法测定OD490值同时设立阳性、阴性血清对照。P/N比值大于2.1时McAbs的最大稀释度即为其效价。经间接ELISA测定，获得2株阳性杂交瘤细胞，其培养上清及腹水效价(表1)。
表1 杂交瘤细胞培养上清及腹水抗体效价
Table 1 The titers of antibodies in cell supernatants and ascitesof McAbs BC4 and 2A10
McAbs
BC4
2A10
细胞培养上清
Cell supernatant
1∶1.60×103
1∶0.80×103
腹水
Ascites
1∶2.56×106
1∶1.28×106
2.3 腹水单抗饱和值测定
将杂交瘤细胞腹水分别进行系列稀释，然后用间接ELISA法测OD490值，以OD490值明显降低的前一个稀释度作为单抗饱和浓度值。经间接ELISA测定，2株阳性杂交瘤细胞腹水抗体的饱和度均为1∶106。
2.4 单抗特异性鉴定
2.4.1 ELISA检测两株单抗与HEV的反应性 分别用纯化的原核表达的ORF2-M1蛋白，ORF2其他部分片段的蛋白PproDQ1，AG02为抗原，进行间接ELISA试验。结果表明，2株单抗只与原核表达的ORF2-M1蛋白发生反应(表2)。
表2 间接ELISA检测2株单抗与ORF2-M1、PproDQ1和AG02蛋白反应性
Table 2 Reactivity ofMcAbs BC4 and 2A10 with proteinORF2-M1，PproDQ1 andAG02 in indirect ELISA
项目
Item
阳性对照
Positive control
阴性对照
Negative control
BC4
McAbBC4
2A10
McAb2A10
ORF2-M1
1.156 9
0.089 5
1.024 5
0.856 1
PproDQ1
1.148 9
0.078 9
0.045 6
0.035 9
AG02
1.125 4
0.068 7
0.042 5
0.044 1
2.4.2 IFA检测两株单抗与HEV的反应性 将试验中制备的2株McAbs分别用Ⅳ型HEV猪的胆汁，按1∶10倍稀释感染48h以后的A549细胞涂片进行IFA检测，同时分别用猪的阳性、阴性血清做对照，制备的2株MAbs对感染病毒的细胞均呈现阳性反应，多数细胞在其胞浆和细胞膜上出现黄绿色荧光，说明其可以与天然的病毒发生反应，并且与阳性多克隆血清比较，以单克隆抗体为一抗，IFA反应表现出良好的特异性。
2.5 杂交瘤细胞株的染色体分析
对所获得的2株杂交瘤细胞株进行染色体分析，结果见图1、图2和图3，SP2/0细胞的平均染色体数为47～52，而杂交瘤细胞的平均染色体数为85～95，正常小鼠的体细胞染色体数是40。由此可见，杂交瘤细胞是骨髓瘤细胞和小鼠正常体细胞的杂合体。
图1 SP2/0细胞染色体计数
Fig.1 The number of SP2/0 cell’s chromosomes
图2 BC4细胞染色体计数
Fig.2 The number of BC4 hybridoma chromosomes
图3 2A10细胞染色体计数
Fig.3 The number of 2A10 hybridoma cell’s chromosomes
2.6 单克隆抗体抗原识别位点分析
经相加ELISA测定，BC4和2A10两株单克隆抗体两两叠加后的AI值为35.6%，说明它们分别识别不同的抗原表位。
3 讨论
利用北京万泰生物公司戊型肝炎夹心ELISA诊断试剂盒，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生物技术国家重点实验室对全国22个省市地区进行的血清学流行病学研究，几乎所有被检地区都存在猪戊型肝炎病毒感染，而且戊型肝炎病毒感染率呈上升趋势，控制该病刻不容缓[12]。控制戊型肝炎病毒感染发生和蔓延的关键是要做到快速而准确的诊断。在戊肝诊断方面，主要应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、以及RT-PCR等诊断技术[13]，其中许多诊断技术都需要戊肝抗体作为试验材料。单克隆抗体由于具有特异性强、均质性高等特点，将其作为诊断试剂可以显著提高戊肝病毒检测的特异性和敏感性，因此在戊肝防控中具有重要的应用价值。以McAb作为诊断试剂建立的快速诊断方法，易于标准化判定。是今后疾病诊断发展的主要方向。
HEV是一种无包膜单股正链RNA病毒，由于其成熟的细胞培养模型至今尚未建立，因而多采用基因工程表达的重组蛋白或合成肽作为HEV特异性抗体检测的包被抗原，以及作为免疫原制备McAbs和免疫血清。Mast等通过对不同HEV抗体检测方法的比较，发现以HEVORF2编码蛋白作为已知抗原来检测未知抗体有较好的敏感性。许多研究证实，ORF2编码的衣壳蛋白上抗原表位数量多，结构复杂，其富含疏水区的C端2/3部分存在多个免疫优势B细胞表位，包括能诱导中和抗体的抗原结合位点[14]。近年来单克隆抗体在研究蛋白结构及其功能，以及抗原表位的分析和精确定位方面都起到了促进作用。国内外既往的研究表明[14]，利用原核系统表达的HEVORF2224位～660位氨基酸重组蛋白免疫动物能够刺激机体产生特异性抗体，此类抗体不仅有效的抵抗同型HEV病毒株的攻击，而且还具有保护机体免受不同亚型HEV攻击的能力。因此本研究使用的免疫原是含有Ⅳ型HEVORF2C端220个氨基酸残基的ORF2-M1蛋白，制备了2株针对ORF2-M1蛋白的MAbs，对获得的2株单克隆抗体识别抗原位点的初步分析，其识别位点不同，意味着在分析ORF2-M1蛋白的抗原结构上有应用价值，但它们针对表位的具体位置还需要进一步利用相关技术进行确定。
由IFA试验结果可以看到，荧光阳性的细胞数并不多，这与采用原核表达蛋白作为免疫原，蛋白很难形成天然结构有一定关系[15]，原核表达的蛋白由于缺乏翻译后的加工、修饰过程，很难形成天然构象，因而导致抗体与病毒结合力差[16]；也与HEV自身特点有关，目前能支持HEV体外培养的主要细胞系均尚不能产生足够大量的病毒供诊断和疫苗制备所用，所以阳性细胞比例较少。虽然阳性细胞数较少，但由试验结果可以看到染色的细胞普遍较大，与用多克隆抗体的阳性对照相比，特异性更高，因而有利于建立病原特异性的诊断方法。由于这些MAbs均能与天然的病毒发生反应，因此可以作为今后与病原相关研究的检测试剂。
本研究获得的2株针对Ⅳ型HEVORF2-M1蛋白的单克隆抗体，经生物学特性鉴定，具有效价高、特异性好的特点，可作为Ⅳ型HEV诊断试剂，并为建立Ⅳ型HEV的抗原捕获方法提供有力的技术支持，可以预期必将在我国Ⅳ型HEV的防制中发挥重要的作用。