摘 要：为建立检测鸭IFN-γmRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法，根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBRGreen I染料，建立检测鸭IFN-γmRNA的实时荧光定量RT-PCR方法(real-timeRT-PCR)。试验以PCR产物为标准品，建立标准曲线，随后进行熔解曲线分析和稳定性研究。结果Ct值线性范围为12.0～33.0，相关系数为0.997；熔解曲线显示产物为单特异峰，Tm为82.5±0℃；组内变异系数(CV%)为4.26%；组间试验无显著差异(P>0.05)。建立的检测鸭IFN-γ mRNA的Real-timeRT-PCR方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。
关键词：鸭；γ干扰素；实时荧光定量RT-PCR；SYBR Green I
干扰素(interferon，IFN)具有广谱抗病毒、抗肿瘤和强大的免疫调节作用，是目前临床医学、肿瘤学和免疫学等领域的研究热点之一[1-2]。IFN分为Ⅰ型和Ⅱ型，IFN-γ属于Ⅱ型IFN，由T淋巴细胞和NK细胞产生。IFN-γ在机体的免疫应答过程中起着重要的作用，与疾病的发生、发展有着密切的关系。体内IFN-γ及其受体表达发生异常，与机体免疫功能低下或发生病理损伤有关[3-6]。对IFN-γ表达量的准确测定，反映机体的免疫状态、揭示疾病的发病机理、探索感染后机体的免疫应答规律均具有重要意义。
常用的检测干扰素的方法(如放射免疫法、ELISA、MTT法、常规RT-PCR法等)不同程度上存在着灵敏度不高、操作繁杂和难以准确定量等缺点。实时荧光定量RT-PCR技术(Real-timeRT-PCR)是20世纪90年代发展起来的一项检测核酸的新技术[7]，以其灵敏、特异和快速的特点，迅速被应用于功能基因组、分子医学、病毒学、微生物学及生物工艺学等领域。在细胞因子的表达研究方面，Real-timeRT-PCR已成为主流的研究工具[8-12]。而目前尚未见用该方法检测鸭干扰素-γ表达的报道。本试验建立基于SYBR GreenI染料法的检测鸭IFN-γ基因的Real-time RT-PCR方法，为研究鸭IFN-γ在鸭体对鸭病原的应答中的作用打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康樱桃谷肉鸭，购自成都某肉鸭场。
1.1.2 主要仪器 iCycleriQ™荧光定量PCR仪，凝胶成像系统Doc2000为美国Bio-Rad公司产品；ThermoHybaid Px2 thermalcycler PCR仪为英国Thermo Hybaid公司产品。
1.1.3 主要试剂 SYBR®Premix ExTaq™、RNAiso Reagent、TaqDNA聚合酶、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0均购自Takara公司；Gel Extraction MiniKit购自上海华舜生物工程有限公司。
1.2 引物设计及合成
参考GenBank中鸭IFN-γ基因的核苷酸序列，根据保守区域的序列，设计1对用于荧光定量PCR的引物，扩增鸭IFN-γ基因81bp的片段。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。上游引物：5′-AACGCAAGGCTGTGAGTGAG-3′；下游引物：5′-ACTGGCTCCTTTTCCTTTTGG -3′。
1.3 方法
1.3.1 鸭肝脏组织RNA的提取与反转录用RNAiso Reagent提取RNA，按照说明书进行。cDNA的合成按RNA PCRKit(AMV)Ver.3.0说明书进行。
1.3.2 标准品制备以cDNA为模板，Thermo Hybaid P×2 thermal cyclerPCR仪上扩增IFN-γ基因。50 μL反应体系：10 mmol/L dNTPs 2 μL，250 mmol/L MgCl22 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、TaqDNA聚合酶(5 u/μL)0 .5 μL、5×PCR buffer 10 μL、cDNA 2 μL，去离子水补足至50μL。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，63.7 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，进行40个循环；72 ℃5min；4 ℃结束反应。PCR产物经20g/L的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外凝胶成像系统进行检测后，从琼脂糖凝胶上切下目的片段，采用3 S Spin Agarose GelDNA Purification Kit试剂盒按说明书回收纯化。以此纯化的PCR产物作为标准品，10倍系列稀释后用于建立标准曲线。
1.3.3 Real-time RT-PCR条件的优化 采用SYBR Green I染料法，在iCycleriQ™荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。由于扩增片段仅81 bp，为缩短反应时间采用两步法。反应体系为25μL，以出现最小的Ct值和最高的荧光值，以及不出现非特异的扩增产物为标准。分别对循环条件、褪火温度、引物浓度进行优化。
1.3.4 标准曲线的建立采用优化好的条件对IFN-γ进行SYBR Green I Real-timeRT-PCR，以Ct值为纵坐标，以稀释倍数的对数为横坐标，建立标准曲线。
1.3.5 熔解曲线分析 为排除非特异性扩增产物及引物二聚体对real-timeRT-PCR结果影响的可能性，在PCR结束后进行熔解曲线分析以确定PCR产物是否为目的片段。温度以0.5 ℃/10 s的速率从55℃缓慢上升到94 ℃，连续测定PCR产物的荧光强度以获取熔解曲线。
1.3.6 重复性和稳定性试验
1.3.6.1 组内重复性 对同一样本的cDNA设20复管同时检测，计算其Ct值的变异系数(CV%)。
1.3.6.2 组间重复性 对10倍递增稀释的标准品检测后于－20 ℃保存，30 d后重检，比较前后两次的扩增结果和标准曲线的相关性。
2 结果
2.1 标准品制备
总RNA经反转录合成cDNA后，IFN-γ基因进行PCR扩增，得到81 bp大小的片段，与预期目的片段大小一致(图1)。
2.2 SYBR Green I real-time RT-PCR条件的优化
对引物及退火温度进行优化，得到的最佳反应体系为：SYBR®Premix ExTaqTM12.5 μL，引物各0.2μmol/L，模板2 μL，ddH2O 9.5 μL；最佳反应体系为：95℃ 5 min,95 ℃ 15 s,63.7℃ 20 s，进行40个循环。
图1 IFN-γ基因的PCR扩增产物
Fig.1 PCR products of IFN-γgene
2.3 标准曲线
以临界循环次数(Ct)值为纵坐标，以PCR产物的拷贝数的对数为横坐标，获得标准曲线(图2和图3)。结果表明，IFN-γ基因扩增的线性范围广(达7个数量级，Ct值在12～33之间)，相关系数r,＝0.997。
2.4 熔解曲线
IFN-γ基因片段PCR产物的熔解曲线显示为单特异峰，熔解温度Tm值为82.5±0 ℃，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物(图4)。
2.5 重复性和稳定性试验
对同一cDNA样本设20复管检测，IFN-γ基因Ct值变异系数(CV%)为4.26%，扩增曲线见图5；系列稀释标准品相隔30d的两次检测结果，经比较，P>0.05，表明具有良好和重复性和稳定性。
图2 IFN-γ基因的动力学扩增曲线
Fig.2 The dynamic amplication curve of IFN-γgene
图3 IFN-γ基因的标准曲线(r＝0.997)
Fig.3 The standard curve of IFN-γ gene(r＝0.997)
图4 IFN-γ基因的熔解曲线(Tm：82.5±0℃)
Fig.4 The melt curve for IFN-γ gene(Tm：82.5±0℃)
图5 设20复管检测IFN-γ基因的扩增曲线
Fig.5 The amplication curve of IFN-γ gene (20 times)
3 讨论
干扰素对免疫反应，炎症反应具有重要的调节作用，它通过调节免疫反应(包括淋巴细胞活化、增殖、分化、生存和凋亡)在免疫系统中起着重要的作用。KaiserP等[13]研究鸡干扰素对抗马立克品种鸡感染马立克病毒后的应答，表明病毒感染可诱导产生高水平的IFN-γ，从而维持了潜伏感染状态。Tang JT等[3]在研究病毒性肝脏纤维化时，认为IFN-γ的表达水平与肝脏纤维化的严重程度呈负相关。此外，对单纯疱疹病毒(HSV)感染后IFN表达水平变化的研究表明，病毒感染能诱导机体表达IFN[14]，同时HSV通过阻断IFN信号通路来抵抗机体IFN对其抑制作用，以上试验均表明干扰素在疾病的发病机理及机体对各种病原微生物的免疫应答中发挥关键作用。
为研究干扰素的免疫调控机理、病毒与机体之间的相互关系以及机体对病原体的免疫应答，对干扰素mRNA表达的准确定量是非常重要的。然而干扰素含量很低且蛋白半衰期短，常用检测干扰素蛋白及基因的方法(如ELISA、放射免疫法和免疫荧光法、MTT法、常规PCR法等)不同程度地存在着灵敏度低、操作复杂、污染环境、耗时和难以精确定量，对操作者、环境造成毒害的问题。而RT-PCR是目前国内外检测核酸最为快速(从制备样品到报告结果仅需1h～3h)、灵敏(最低可以检测到一个基因的拷贝)、高通量(1次可以同时检测96个或384个样本)和特异的方法，在细胞因子的定量中越来越受到青睐。因此，本试验建立了基于SYBRGreenI染料法的检测鸭IFN-γmRNA的实时荧光定量RT-PCR方法。从试验结果可以看出，所建立的检测鸭IFN-γ基因的real-timeRT-PCR方法具有检测范围广、特异性好、扩增效率高、重复性和稳定性良好等特点，为进行鸭病原与鸭体相互关系的研究打下基础。