摘 要：根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的核酸序列，设计一对引物，采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出ORF2基因，将其克隆到pMD18-T载体上，筛选获得重组质粒pMD18T-ORF2。序列分析表明，克隆的ORF2基因与其他PCV-2ORF2的分离株的同源性在91.5%～99.4%，与杭州分离株的同源性达到99.4%，表明我国各地区之间PCV-2的分离株存在较大的差异。
关键词：猪圆环病毒2型；ORF2基因；克隆；序列分析
猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科、圆环病毒属，病毒粒子为20面体对称，以滚环方式进行复制，该病毒的基因是一种环状、无囊膜、单链DNA[1]。PCV-2全基因为1 767 bp或1 768bp，共有11个阅读框，其中ORF1和ORF2是其主要的阅读框。ORF1编码病毒的复制蛋白，与PCV-1的ORF1编码的蛋白有相同的抗原性。而ORF2编码病毒的结构蛋白，具有较好的免疫原性，是构成重组疫苗和检测的首选基因[2-5]。Allan G M等[6]首先在患断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪群中分离到PCV-2，并证明为PMWS的重要病原[7-8]。许多国家和地区的猪群检测到猪圆环病毒2型(PCV-2)。在国内，朗洪武等[9-10]分别通过血清学和病原学调查表明，我国已有PCV-2的流行。PCV-2常和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)混和感染[6]，造成猪的免疫失败，给养猪业带来重大的经济损失。
1 材料与方法
1.1 病料
江西、湖北二个省采集的病料(断奶仔猪的脾、肾、淋巴结等)，编号分别为JX、HB。
1.2 试剂
DNA提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒、pMD18-T vector、T4DNA连接酶等均购自宝生物工程(大连)有限公司；JM109由甘肃农业大学动物医学院实验室保存。
1.3 引物
根据GenBank中已发表的PCV-2ORF2的核苷酸全序列，设计一对引物P1：GCGCTCGAGTTAGGGTTTAAGTGGGG，P2：GCGGGATCCATGACGTATCCAAG，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.4 模板的制备
取少量死亡猪组织病料充分研磨制成悬液，反复冻融3次，离心取上清，用DNA提取试剂盒提取DNA，取适量用作PCR模板。
1.5 ORF2基因的扩增
PCR的反应体系50 μL，反应成分如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，DNA Polymerase0.25 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL(10 pmol/L)，加灭菌超纯水补至50μL，均匀混和。PCR反应：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min,72 ℃ 1.5min，进行35个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后取5 μL PCR产物，于10 g/L琼脂糖凝胶中电泳分析。
1.6 PCR产物的克隆
将PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳，切下含目的条带的凝胶，用DNA回收试剂盒回收PCR产物，按常规方法与pMD18-T载体连接；将连接产物转化大肠埃希菌JM109感受态细胞，涂布于含IPTG(24 mg/ mL)和X-gal(20 mg/mL)的LB固体培养基上，37 ℃培养12h，挑取上述转化平皿中的白色菌落，接种到含有Amp( 100 μg/ mL)的LB液体培养基。37℃振荡培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定。筛选出阳性重组质粒。将阳性重组质粒送到上海生物技术有限公司测序。
1.7 序列分析
将测序结果用DNA Star软件与GenBank中其他PCV-2毒株ORF2基因的核苷酸进行同源性比较。
2 结果
2.1 ORF2基因的PCR扩增
PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析表明，扩增出与ORF2相应的目的片段，与预期结果相符(图1)。
M.DNA标准DL 2 000；1.JX株；2.HB株
M.DNA Marker DL 2 000；1.JX strain；2.HB strain
图1 图1 ORF2基因的PCR扩增结果
Fig.1 PCR products of ORF2 gene
2.2 重组质粒的筛选结果
PCV-2 ORF2的重组质粒用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切可切出一条700 bp左右的片段(图2)。
M.DNA标准DL 2 000；1.JX株；2.HB株
M.DNA Marker DL 2 000；1.JX strain；2.HB strain
图2 重组质粒PMD 18-ORF2的酶切鉴定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid PMD 18-ORF2
DNAStar分析软件对这些序列进行同源性分析发现，PCV-2毒株的ORF2基因之间核苷酸序列的同源性很高，介于91.5%～99.4%之间，进化树的分析发现HB株与杭州的分离株的亲缘关系比较近(图3)。
图3 PCV ORF2基因的系统发育进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of PCV ORF2 genes
3 讨论
PCV-2与猪的多种疾病综合征有关，其中研究比较深入的是断奶仔猪多系统衰竭综合征，严重影响养猪业的发展。Fenaux M等[11]研究表明，遗传树的小分支与地域有关，但它们都在各自的地域缓慢的发生进化。有研究表明，通过氨基酸序列比较，发现在临床症状不同的PCV-2感染中，其ORF2有微小差异，推测ORF2的微小变化可能是临床症状变化的主要原因[12]，Larochelle R等[13]通过对不同症状的PCV-2分离株的遗传树构建，表明PCV-2的不同小分支和症状不同之间没有明显的关系。表明PCV-2的变异引起不同症状的能力仍有待于进一步研究，也许混合感染的共致病因子对不同的症状有一定的影响。
本研究所克隆的两株毒株的ORF2基因与其他PCV-2毒株的ORF2基因核苷酸序列的同源性在91.5%～99.4%之间，其中与河南分离株的同源性只有91.5%，而与杭州、西班牙的分离株的同源性达到99.4%，说明国内分离或检测到的PCV-2的基因序列较为复杂，各地区间的差异较大，这些差异可能与国内猪的引进有一定的关系。由于PMWS不仅给养猪业造成严重的经济损失，同时其作为一种新的传染病，也给人类健康造成了威胁，因此应加强生猪的运输检疫和饲养管理。