牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分离鉴定

摘　要：从奶牛分离得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)。按常规方法复苏菌株，用血浆凝固酶试验鉴定SA。用KB法、琼脂筛选法、生化鉴定法(VITEK32)、聚合酶链反应等鉴定MRSA。常规分离鉴定的葡萄球菌468株，其中凝固酶阴性葡萄球菌(coagulasenegativeStaphylococcus，CNS) 361株，检出率为77.14%，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)105株，检出率为22.44%，MRSA36株检出率为34.29%,2株未定型，占0.42%。而MRSA在乳房炎奶样中检出率高达34.29%，表明新疆兵团部分垦区牛场MRSA已经呈蔓延趋势。

关键词：金黄色葡萄球菌；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；乳房炎；奶牛

自1961年Jevons首次报道了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以来，MRSA在世界许多国家和地区相继出现。特别是近几年，引起的院内感染(nosocomialinfection)已经成为越来越严重的问题^[1]。由于金黄色葡萄球菌不能引起动物的死亡或者是立即发病，所以在动物上的重视程度不够，但随着人们生活水平的提高，人们对乳制品的质量也有了更高的要求，近年来有关MRSA的研究也逐渐增多。MRSA的耐药机制虽未完全阐明，但已证实与细菌产生的一种新的青霉素结合蛋白2a(penicillinbinding protein2a，PBP2a)密切相关。PBP2a是由染色体mecA基因编码，目前已获得了该基因的克隆，其序列也已发表^[2]。mecA在耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(methicillin-resistant CNS，MRCNS)中也有检出^[3-4]。femA (factors essential for the expression of methicillinresistance gene)是MRSA耐药辅助基因，所编码蛋白与细胞壁肽聚糖五甘氨酸桥合成有关^[5]。而femA基因在CNS中罕见^[6]。因此mecA、femA基因联合扩增不仅能快速筛检耐药株，还免去了繁琐的生化鉴定^[7]。本文通过应用聚合酶链反应(PCR)及细菌分离培养技术对本区(石河子兵团垦区)近2000头奶牛(乳房炎疑似病畜133头)采样分离得到了105株SA，其中有36株MRSA，为奶牛乳房炎的控制与用药提供指导。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　标本来源　2007年5月从新疆石河子垦区134团中心奶牛场采得临床标本中收集经常规鉴定的葡萄球菌，从中筛检出金黄色葡萄球菌菌株，CNS和质控菌株ATCC25923购自乌鲁木齐临床检验中心。菌株均置4 ℃冰箱保存。

1.1.2　主要药品　苯唑西林(Oxacillin)由重庆药友制药有限责任公司生产，苯唑西林纸片(1μg/片)由北京天坛药物生物技术开发公司生产。

1. 1. 3　培养基　50 mL/L羊血琼脂培养基、M-H培养基、耐甲氧西林葡萄球菌筛选培养基(卵黄高甘培养基)均为自制。

1.2　方法

1.2.1　培养基初筛　按常规方法复苏菌株，用血浆凝固酶试验重新鉴定SA和CNS^[8]。

卵黄高盐甘露醇平板分离SA(在37 ℃温箱培养48 h)

卵黄高盐甘露醇平板的制备(1 000 mL)：蛋白胨10 g，牛肉膏1 g，氯化钠75 g，琼脂粉20 g,1 g/L酚红溶液25mL，甘露醇10 g，调pH到7.4，补水至1 000 mL,121.3 ℃高压灭菌15 min，冷却至55 ℃加入120g鸡蛋黄2个制板备用。

1.2.2　KB法　按KB法药敏试验操作^[8]，SA和CNS 35 ℃孵育24 h，同时做质控菌株对照。根据1999年NCCLS判断标准，SA抑菌圈≤10 mm为耐药(R),11mm～12 mm为中介(I)，≥13 mm为敏感(S)。CNS抑菌圈≤17 mm为耐药(R)，≥18 mm为敏感(S)。

1.2.3　琼脂筛选法　制备含40 g/L NaCl及6 μg/mL苯唑西林(购自英国BBI公司)的MH琼脂(NCCLS标准)。葡萄球菌液调至0.5麦氏管浊度，用棉拭子浸沾后点种在筛选琼脂上。SA35 ℃孵育24 h，CNS 35 ℃孵育48 h^[9]，同时做质控菌株对照。生长为耐药，不生长为敏感。

1.2.4　生化仪器鉴定法　利用石河子大学第一附属医院VITEK32型全自动鉴定及药敏分析仪对常规方法分离的菌株进行生化鉴定(表1)。

1. 2.5　PCR鉴定法　应用聚合酶链反应技术，克隆mecA、femA部分基因来检验MRSA^[10]。

从卵黄高盐甘露醇平板筛选法筛出的62株菌株中随机挑取8株疑似MRSA菌株、另选一株MRCNS和两株SA进行PCR反应。

mecA、femA基因联合扩增引物(引物合成自上海生工生物工程技术有限公司)：

mecA1：5′AAGCTTAGGAGGATATTGATGAAAAAG 3′。

mecA2：5′CCATGGTTATTCATCTATATCG 3′。相应PCR产物1 082 bp。

femA1：5′CTTACTTACTGGCTGTACCTG 3′。

femA2：5′ATGTCGCTTGTTATGTGC 3′。相应PCR产物686 bp。

PCR反应条件：95 ℃ 4 min,95 ℃ 50 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,30个循环；72 ℃，7 min。

反应体系25 μL。10×buffer(含Mg^2＋)2.5 mL，dNTP 2.5 mmol/L 0.8 mL，上游引物20 mmol/L 0.3 mL，下游引物20 mmol/L0.3 mL，TaqDNA聚合酶2.5 U/mL 0.3 mL，模板DNA 0.3 mL，纯水20.5 mL。

2　结　果

2.1　金黄色葡萄球菌分离

常规鉴定的葡萄球菌105株，其中金黄色葡萄球菌SA 62株，2株未定型。

2.2　KB法

检出金黄色葡萄球菌SA 64株。

2.3　琼脂筛选法

在卵黄高甘平板上生长有62株出现生长菌落。

2.4　耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生化鉴定

经VITEK32型全自动细菌鉴定仪检测及药敏分析仪检测从卵黄高盐甘露醇平板筛选法筛出的62株菌株中随机挑选的3株菌株，结果检出1株SA；2株MRSA，命名为LC506。

表1　VITEK32型全自动药敏分析仪检测MIC

Table 1　Medcine MIC test using VITEK32 medicine sensitivity testapparatus

2.5　耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子生物学鉴定

从62株卵黄高甘平板生长菌株中随机抽取的8株经PCR联合扩增检出均呈阳性即MRSA。

在全部收集近200份奶样中共检出葡萄球菌105株，其中金黄色葡萄球菌SA62株，2株未确检。对62株SA菌株进行PCR联合扩增，检出MRSA阳性菌株13株，检出率为20.10%。

3　讨论

mecA是MRSA耐药决定基因，91.7%的MRSA含mecA。而仅58%的MRCNS含mecA，且约30%的MSCNS菌株mecA检测阳性。因此mecA种间转移可能是MRCNS耐药机制之一。但mecA在CNS耐药机制中所占地位尚难评价。femA是金黄色葡萄球菌的功能基因；femA在低～高度耐药的菌株中均有分布，说明femA的辅助耐药性与femA是否存在无关，而可能与femA表达水平有关。研究证实femA是MRSA耐药辅助基因，其编码相对分子质量为48ku的蛋白参与细菌胞壁肽聚糖五甘氨酸桥合成。femA插入失活，将导致细胞壁结构改变，而对β-内酰胺类抗生素敏感性上升。PCR具快速、敏感性高、特异性强的优点，国外用PCR检测mecA已有报道。有研究显示在金黄色葡萄球菌中以mecA阳性为指标筛检MRSA的敏感性、特异性分别可达92%、95%^[7]。CNS与金黄色葡萄球菌同是革兰氏阳性菌，细胞壁结构类似，但femA在CNS中检出极少，甚至检不出。推测与CNS中femA变异或所扩增片段不在femA保守区有关。因此选用适当引物进行femA基因PCR扩增可用于金黄色葡萄球菌与CNS种间鉴别。

金黄色葡萄球菌的分离鉴定利用常规鉴定方法、KB法、琼脂筛选法，都确实获得了金黄色葡萄球菌菌株，检测结果差异性很小，我们认为针对SA利用特异性培养基(卵黄高干培养基)进行检测更加方便快捷且准确；针对MRSA我们无论是利用生化仪器鉴定，还是PCR联合扩增法；均可检出奶样中存在有MRSA，且检出率占金黄色葡萄球菌总数的20.10%以上，证明新疆石河子垦区奶牛乳房炎感染中，其病原中已经有MRSA菌株出现，此趋势可能反映全国范围内动物源性MRSA感染开始蔓延，分析原因可能与近年来在动物身上(尤其是奶牛等经济价值较高的动物身上)的滥用抗生素，导致金黄色葡萄球菌产生耐药相关。

本试验证明MRSA已经在与人类生活密切相关的动物身上出现，在制药工业不断发展的同时，金黄色葡萄球菌也在不断的进化来抵御外界的干扰，这给我们治疗由该菌引起的疾病带来了难题，MRSA在奶牛身上的检出对我们预防兽医学和食品卫生安全将是一个非常严峻的考验，也给我们研究动物源性MRSA和研制治疗奶牛乳房炎药物指明了方向。