副猪嗜血杆菌培养条件的筛选及对豚鼠的致病性试验

摘　要：为筛选副猪嗜血杆菌最适培养基，将副猪嗜血杆菌血清5型标准株(Nagasaki菌株)接种固体培养基TSA、PPLO琼脂、巧克力琼脂、胰月示蛋白胨琼脂和液体培养基TSB、PPLO液体、胰月示蛋白胨和马丁肉汤，通过观察菌落大小和平板计数，筛选出副猪嗜血杆菌生长最适培养基。将Nagasaki菌株接种TSB培养基，取10h～16h不同培养阶段的培养物，腹腔接种豚鼠，确定副猪嗜血杆菌感染实验动物的最佳培养阶段。结果表明，TSA和TSB是副猪嗜血杆菌的最适培养基，副猪嗜血杆菌血清5型接种于TSB中，在37℃、200 r/min培养10 h～13 h，菌数可达到10⁹cfu/mL。

关键词：副猪嗜血杆菌；培养基；感染试验

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌，是猪Glasser’s病的病原体^[1]，本病以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。随着规模化、集约化猪场的发展，HPS给养猪业带来巨大的经济损失，HPS引起的疾病已逐渐成为世界范围的重要疾病^[2]，特别是在新暴发的细菌性传染病中具有一定的代表性和主要地位。由于HPS比较脆弱，对营养要求严格，在体外培养保存易死亡。因此，HPS在体外培养时，培养基的营养成分和培养时间对HPS致病试验是关键因素。本试验主要通过平板计数和菌落生长大小观察HPS在几种液体和固体培养基中生长情况，筛选出了最适培养基，缩短了副猪嗜血杆菌的分离培养时间，为抗原的制备奠定基础。并通过腹腔接种豚鼠，为副猪嗜血杆菌感染致病试验提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　培养基及附加成分　TSA、PPLO琼脂、巧克力琼脂、胰月示蛋白胨琼脂；TSB、PPLO液体、胰月示蛋白胨液体和马丁肉汤；NAD和鲜酵母浸出液。

1.1.2　菌种　副猪嗜血杆菌血清5型标准株(Nagasaki菌株)，由澳大利亚昆士兰动物研究所Pat Blackall博士惠赠。

1.1.3　实验动物　清洁级豚鼠由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物场提供。

1.2　方法

1.2.1　培养基配制　TSA、PPLO琼脂、胰月示蛋白胨琼脂、TSB、PPLO液体、胰月示蛋白胨液体培养基，加入无菌马血清、NAD和鲜酵母浸出液，终浓度分别为10%、0.5%和3%。

1.2.2　固体培养基的筛选　将纯化的Nagasaki菌株分别接种于TSA、PPLO琼脂、胰月示蛋白胨琼和巧克力琼脂培养基，在37℃、体积分数为5% CO₂培养箱培养，观察每种培养基在不同时间菌落大小。

1.2.3　液体培养基的筛选　将纯化的Nagasaki菌株分别接种于TSB、PPLO液体、胰月示蛋白胨液体和马丁肉汤培养基，于37℃、200 r/min摇床培养，10 h后，每隔2 h分别取样，进行平板计数。

1.2.4　致病力试验　将纯化的Nagasaki菌株接种于TSB培养基，于37 ℃、200 r/min摇床培养，10 h后，每隔1h取样，参照文献[3]等方法，腹腔注射豚鼠，观察豚鼠的死亡情况。

2　结果

2.1　菌落大小观察

接种副猪嗜血杆菌的TSA、PPLO琼脂、胰月示蛋白胨琼和巧克力平4种培养基，培养12 h开始观察各种培养基菌落生长大小，结果见表1。

表1　培养不同时间不同培养基菌落大小比较

Table 1　The comparison of colony diameters on several kinds ofsolid media in different time

对TSA、PPLO琼脂、巧克力琼脂、胰月示蛋白胨琼脂四种固体培养基进行比较，从表1结果显示TSA和PPLO两种固体培养基在37℃温箱24 h～36h形成丰满的菌落，而巧克力琼脂和胰月示蛋白胨琼脂形成针尖大小和比较小的菌落。从表1看，TSA是HSP最理想的固体培养基。

2.2　液体培养物平板记数

取TSB、PPLO液体、胰月示蛋白胨液体和马丁肉汤培养基不同时间段的体外培养物，进行平板计数结果见表2。

表2　不同培养基不同培养阶段菌数比较

Table 2　The comparison of colony form units on several kinds ofliquid media in different timecfu

从表2中可以看出，副猪嗜血杆菌在TSB和胰月示蛋白胨液体培养基中生长良好，在10 h～16 h菌数都达到10⁹cfu。通过以上试验确定TSB和胰月示蛋白胨为副猪嗜血杆菌较适液体培养基。

2.3　动物试验结果观察

在37 ℃、200 r/min摇床培养条件下，分别取不同培养时间的副猪嗜血杆菌血清5型TSB培养物，腹腔注射豚鼠，注射剂量为1mL。结果如表3所示。

表3　豚鼠致病性试验

Table 3　The pathogenicity test in guinea pigs

试验结果显示，副猪嗜血杆菌血清5型TSB培养物，在11 h～13 h培养阶段对豚鼠具有感染力，在培养11 h对豚鼠的致病性最强。

3　讨论

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的一种常在菌，在特定的条件下可以侵入机体引起全身性感染，引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征性的疾病^[4]。Glsser于1910年首次描述了浆液性纤维素性胸膜炎、心包炎以及脑膜炎患猪的浆液性分泌物中，存在一种革兰氏阴性杆菌，而该病病原微生物直到1922年才首次分离到^[5]。这可能是由于HPS对营养要求严格，并且还是NAD依赖菌株，另一方面，HPS在体外很容易死亡，因此分离培养比较困难。

本试验通过对PPLO琼脂、巧克力琼脂、胰月示蛋白胨琼和TSA固体培养基和TSB、PPLO液体、胰月示蛋白胨液体、马丁肉汤液体培养基进行比较，筛选出了较适合HPS生长的固体和液体培养基TSA和TSB。本试验的结果表明，HPS在其他3种固体培养基均生长，但生长菌落比较小或培养持续时间长。本试验筛选出的TSA培养基，菌落生长丰满，培养时间较短。液体培养基胰月示蛋白胨和TSB液体在培养10h均能达到10⁹cfu，持续培养过程中，16 h左右时，每种培养基中的菌数量达到最大量，24h后细菌大量死亡，但HPS在TSB培养基中死亡速度较缓慢。因此TSB是HPS比较理想的培养基。

HPS十分娇嫩，对培养基营养要求苛刻，在含马血清和鲜酵母浸出液的TSB培养基生长良好。O’ReillyT等^[6]研究了以胰蛋白胨-酵母提取物肉汤作为培养基用于制备实验感染的接种物，发现处于生长稳定期的HPS继续培养后伴随着活力显著下降。为探索HPS感染实验动物的最佳培养时间，本试验通过Nagasaki菌株在TSB培养基中不同时间的培养物，进行腹腔感染豚鼠。结果11、12、13h的培养物感染豚鼠时，豚鼠出现了死亡，其中接种11h的培养物时，实验豚鼠基本全组出现了死亡。结果表明，含马血清和鲜酵母浸出液的TSB培养基在37 ℃，200 r/min摇床培养11h～13 h，此培养阶段HPS对实验动物的致病力最强。这一结果为HPS感染实验动物提供依据。

另外，HPS的动物感染试验是研究者十分关注的问题，为研究HPS的毒力、致病性和免疫性，研究者已对数种动物模型和感染途径进行了试验^[7-9]。但由于HPS是猪上呼吸道的一种常在菌，因此，用普通条件下的猪进行感染试验结果重复性很差。因而研究者采用剖腹产不喂初乳和自然分娩后不喂初乳仔猪^[10]、SPF猪和初乳缺乏和母猪喂养(SR)仔

猪^[11]作为动物模型进行感染试验，复制出了Glasser’s病的病理模型。由于这两种实验动物饲养成本高，饲养条件要求严格，选择普通实验动物替代上述实验动物进行感染试验是急需解决的工作。本试验用HPS的培养物感染豚鼠，结果豚鼠出现了死亡，这为豚鼠作为HPS的感染动物模型的候选动物奠定了基础。