摘 要：应用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出PCV-2全基因组(1 767bp)，将此基因片段克隆入pMD20-T载体，筛选获得重组质粒pMD-PCV2并对其进行序列测定，然后对全基因组进行同源性和遗传进化分析。结果表明，PCV-2分离毒株与参考株的全基因组同源性介于94%～98.4%之间，ORF1的同源性介于97.0%～98.8%，ORF2的同源性略低，介于91.9%～98.4%之间。该毒株与荷兰株、广西株和上海株等在一个进化分支上。本研究有助于监测PCV-2的疫源和进化关系，为进一步深入研究病毒基因功能奠定一定基础。
关键词：猪圆环病毒2型；基因组；克隆；序列分析
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)与鸡贫血病毒(Chicken anemiavirus，CAV)、鹦鹉喙羽病毒(Psittacine beak and feather diseasevirus，PBFDV)和一些植物病毒同属于圆环病毒科(Circoviridae)成员。病毒粒子为20面体对称，以滚环方式进行复制，该病毒的基因组是一种环状、无囊膜、单链DNA[1]。
PCV-2病毒是由Allan G M等[2]首先从患断奶仔猪多系统衰弱综合征(Post-weaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)的猪群中分离到的，被证明为PMWS的重要病原之一。目前在德国、法国、西班牙、加拿大、美国、日本和印度等国家和中国已有检测到PCV-2的相关报道[3]。病猪表现为生长缓慢，消瘦，贫血，黄疸，呼吸困难，剖检可见淋巴结肿大，肝硬变，多灶性黏液脓性支气管炎，间质性肺炎，病死率达50%左右，存活猪成为僵猪。PCV-2常和猪繁殖与呼吸综合征病毒、细小病毒、伪狂犬病毒混合感染[4-6]，造成猪的免疫接种失败，给养猪业带来重大经济损失。
本研究旨在采用PCR方法克隆得到河北保定(HBBD0608)株PCV-2全基因组，并对其进行序列分析，为该病毒的分子生物学、流行病学、致病机理等相关领域的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 病料、质粒、菌种
PCV-2由河北省保定市某猪场的送检病料中分离，命名为HBBD0608株；感受态细胞DH5α、载体pMD20-TVector购自宝生物工程(大连)有限公司，载体pEGFP-N1和PK-15细胞由本实验室保存。
1.2 试剂
PCR试剂盒，DNAMarker，DNA提取试剂盒，DNA片段回收试剂盒，IPTG，X-gal购自宝生物工程(大连)有限公司、质粒提取试剂盒购自博大泰克公司；各种限制性内切酶，购自Promagar公司；限制胜内切酶HindⅢ、KpnⅠ购自美国Promega公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.3 病毒培养
取采自河北保定市某猪厂的经过鉴定为PCV-2的阳性病料组织，研磨后制成悬浮液，冻融3次，8 000 r/min离心10min，取上清，加青霉素(100单位/mL)、链霉素(100 μg/mL)4 ℃作用8 h后，接种PK15细胞，培养48 h～72h传一代，共传8代。
1.4 引物的设计与合成
根据已发表的PCV-2序列(GenBank：登录号为No.DQ218420)设计一对特异性克隆测序引物PCV-2-F5′-CGATAAGCTTACCAGCGCACTTCGGCAGCGGCA-3′；PCV2-R：5′-GCTTGGTACCACTTACAGCGCACTTCTTCG-3′。包含HindⅢ、KpnⅠ两个酶切位点，可扩增长为1 767 bp的核苷酸序列。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，使用浓度为20 pmol/μL。
1.5 模板的制备
取培养细胞悬液，按照宝生物工程(大连)有限公司DNA提取的试剂盒说明书提取细胞DNA。
1.6 PCV-2全基因组PCR扩增
用1.5制备的病料DNA为摸板，用引物PCV2-F、PCV2-R扩增出带有HindⅢ、KpnⅠ酶切位点的PCV-2全基因组大小为1 767 bp的DNA片段。PCR反应总体系为50μL，反应成分如下：LA-Taqbuffer 5μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 4 μL，LA-Taq(TaKaRa PCR™ Kit Ver.2.1)0.5 μL，加超纯水至总体积50 μL。扩增PCV-2全基因组的PCR程序为：95℃ 10 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4℃保存。
1.7 PCR产物的克隆与测序
将PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，切下含目的条带的凝胶，按说明书用DNA回收试剂盒回收PCR产物，按常规方法[5]与pMD 20-T载体进行连接；将连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，37 ℃培养12h，挑取上述转化平皿中的白色菌落，接种到含有Amp(100 μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至混浊，提取质粒并进行酶切鉴定后送宝生物工程(大连)有限公司测序。
1.8 序列分析
将阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序，将测序结果利用DNAStar生物学软件与国内外发表的PCV序列进行同源性和系统进化分析。
2 结果
2.1 PCR扩增产物电泳结果
PCV-2全基因组PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，用设计的引物都成功地扩增出预期的目的条带，其大小都约为1 767bp，与预期的大小一致(图1)。
2.2 PCV-2全基因组的PCR产物克隆入pMD20-T载体
PCV-2全基因组分别用PCV2-F、PCV2-R扩增的PCR产物克隆入pMD20-T载体，获得的重组质粒pMD -PCV2经HindⅢ、KpnⅠ双酶切，出现了约1 767bp的条带(图2)，说明两对引物扩增PCV-2全基因组已成功克隆入pMD20-T载体。测序结果证实PCV-2 DNA克隆正确。
1～2.PCV-2基因组；3.DNA标准DL 2 000
1-2.PCV-2 genome；3.DNA Marker DL 2 000
图1 PCV-2全基因组的PCR扩增
Fig.1 PCR amplification of PCV-2 genome
1～2.重组质粒T-PCV-2酶切产物；3.以重组质里粒为模板的PCR产物；4.DNA标准DL250
1-2.PMD-PCV-2(DB)/HindⅢ，KpnⅠ；3.PCR product amplified from recombinent plasmid；4.DNA MarkerDL250
图2 重组质粒T-PCV-2酶切及PCR鉴定
Fig.2 Iditification of recombinant plasmid T-PCV-2 by restrictionendonuclease digestion
2.3 测序结果、同源性比较及系统进化分析
如图3，分离得到的PCV-2河北(HBBD)株与荷兰的AF201897分离株同源性最高，为98.4%，与广西分离株EF675237、上海分离株No.AY291318和山东分离株DQ218420的同源性分别为98.2%,98.1%和98%。与丹麦EU148507分离株同源性最低为94%。
图3 遗传进化树
Fig.3 Phylogenetic tree
从图3系统进化树可以看出，PCV-1和PCV-2两个基因型差异较大，明显分为两支，2株PCV-1分离株之间的基因组序列同源性为99.6%，PCV-2各分离株基因组序列之间的同源性在93.0%以上。但PCV-1和PCV-2分离株之间只有70%左右的同源性。所选PCV-2分离株共分成两个大的分支，两个分支中一支以基因组长度为1767 bp的为主，另一支以1 768bp为主。分离株的同源性与国别并无特别的联系，分离株与荷兰株(AF201897)的同源性最高，美国分离株(AF147751)和南非分离株(AY325495)同源性高达99%，美国分离株(AF147751)和日本分离株(BD309028同源性高达99.1%，日本分离株(BD309028)和南非分离株(AY325495)同源性高达99.7%，我国的广西株(EF675237)与荷兰株(AF201897)同源性为99.8%，同时也验证了PCV-2的全基因组核酸序列比较保守的说法。
3 讨论
目前PCV-2已经在世界范围内广泛存在，其全基因组大小有1 767 bp和1 768bp两种，本研究所克隆的河北省保定株PCV-2全基因大小为1 768bp，与其基因组大小相同的毒株同源性较高，在95.5%～98.4%之间；而与全基因大小为1 768bp的毒株同源性低一些，在94%～96%之间。由此可见，所有PCV-2毒株的核苷酸序列都有较高的同源性，说明PCV-2毒株间的亲缘关系很近，PCV-2病毒进化速度较慢。
PCV-2基因组含有11个开放阅读框(ORF)，组成单股环状双向DNA，由2个头头相对排列的ORF和其间的基因间隔区组成，包含复制酶相关基因(Rep)、结构蛋白或衣壳蛋白基因(Cap)及病毒DNA复制起始区茎环序列。其中较大的ORF1(819nt～1 759 nt)经病毒正向DNA转录，为Rep基因，编码病毒复制酶相关蛋白(Rep)；较小的ORF2(34 nt～736 nt)经病毒DNA互补链转录，为cap基因，编码大小约27.9 ku的病毒主要结构蛋白或衣壳蛋白(Cap)[7-8]。在PCV-2的11个阅读框中，研究较深入的是ORF1和ORF2。Nawagitgul P等[9]认为ORF1编码蛋白与PCV的复制有关，而ORF2编码结构蛋白，用杆状病毒表达ORF2基因发现，在电镜下能观察到ORF2蛋白可以自我装配成病毒衣壳样颗粒。
虽已证明PCV-2是PMWS的主要病原，但目前为止，还没有有效的疫苗预防此病。有报道称使用纯化的病毒为抗原研制诊断试剂，但因为病毒的体外培养困难，加上病毒粒子太小，分离纯化困难，因而代价太高。采用原核表达系统制备重组病毒抗原蛋白，可以做到产量高，成本低，加上比较成熟的蛋白分离技术，可以大大提高诊断反应的敏感性和特异性。韩凌霞等[10]将Rep和Cap基因的部分片段亚克隆到大肠埃希菌表达载体上进行表达，发现Cap蛋白羧基端部分是诊断PCV-2感染的良好抗原。本试验所分离测定的PCV-2河北株基因组全长为1767 bp，用DNAStar生物学软件与国内外发表序列进行同源性分析发现，PCV-2分离毒株与参考株的全基因组同源性介于94.0%～98.4%之间，ORF1的同源性介于97.0%～98.8%，ORF2的同源性介于91.9%～98.4%之间。对流行毒株的Cap基因进行克隆表达，获得的重组抗原蛋白对该病的诊断和预防具有很好的应用前景。同时利用该毒株进行PCV-2的分子生物学、流行病学、致病机理等相关领域的研究应该具有一定的代表性。