复方秦皮药物是西南民族大学生命科学与技术学院药理教研室田淑琴教授根据临床经验总结出的经验方经科学研制而成，该处方制剂为四川省科技厅及国家民委资助项目，项目名称为藏药“化结丹”临床前药理研究和藏药“黄百灵”临床应用调查（项目编号为川科委计（1999）9号和民委发（2002）127号）；并且于2006年3月22日获国家发明专利，处方主要由君药秦皮、臣药瞿麦等按一定重量配比制备而成。前期研究显示，复方秦皮药物对大肠杆菌K88具有很好的抗菌作用，治疗仔猪白痢的有效率和治愈率均为98%，治疗仔猪黄白痢的有效率和治愈率均在95%以上[1]，预防用药在发病前，效果明显，对肠道菌痢作用效果良好。但通过其最佳水提方法得到的提取液含杂质较多、颜色过深，给临床应用带来不便，所以我们就此问题进行了展开研究，以期待其能得到更加广泛的使用和更加充分的体现其临床疗效。
一、材料
复方秦皮（市售，配方由西南民族大学动物药理实验室提供）；无水乙醇（成都长联化工试剂有限公司）；医用活性炭（市售）；其他试剂均为分析纯。
HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；SR-1605A电磁炉（尚朋堂股份有限公司）；AL201电子天平（METTLERTOLEDO，感量为万分之一）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；RE-3000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Eppendorf5804高速离心机（德国生产）。
二、提取液的制备
（一）提取液的处理原理药材经水煎后，除有效成分被提出来以外，还浸出了淀粉、树脂、蛋白质、色素、无机盐等无效成分。此时，将提取液浓缩至每毫升相当于生药1～2g加入适量乙醇，可将杂质去除。通常淀粉在50%～60%的乙醇中即可沉淀，无机盐在60%乙醇中沉淀，蛋白质在75%以上的乙醇中才能沉淀。因此，我们采用三级醇沉的办法来将杂质去除。
（二）提取液制备按处方比例称取已经过粉碎的复方秦皮药材900g，混合均匀。按最佳水提工艺条件进行提取，即加入7倍量水，煎煮2次，每次90分钟。最后将药渣回流提取30分钟，合并药液。冷却，滤过，合并滤液，将滤液浓缩至每毫升相当于生药1～2g，加入无水乙醇使含醇量达到60%，将醇沉液4℃冷藏12小时，离心15分钟（5500r/min），取上清液，过滤，用旋转蒸发仪将药液浓缩，回收乙醇至无醇味；加入无水乙醇使滤液含醇量达到70%，将醇沉液4℃冷藏24小时，离心15分钟（5500r/min），取上清液，过滤，用旋转蒸发仪将药液浓缩，回收乙醇至无醇味；加入无水乙醇使含醇量达到80%，将醇沉液4℃冷藏36小时，离心15分钟（5500r/min），取上清液，过滤，醇液用1mol/LNaOH溶液将pH值调至7.8，静置24小时，离心15分钟（7000r/min）取上清液，过滤，用旋转蒸发仪将提取液浓缩，回收乙醇至无醇味。过微孔滤膜（0.45μm），加适量蒸馏水烧沸后4℃冷藏24小时，得到提取液。
三、提取液脱色工艺研究
（一）脱色原理复方秦皮提取液中含有较多有色物质，使得溶液颜色较深，如不除去则为后续纯化操作带来麻烦。因此有必要对复方秦皮提取液进行脱色,我们选择医用活性炭进行脱色研究。通常用于中药提取液脱色的是粉末状活性炭,具有很强的吸附能力，可以将溶液中的有色物质吸附在表面上,从而达到脱色的目的。使用前活性炭需进行预处理,将适量粉末状活性炭(100～120目)于120℃下加热活化4～5小时,以除去所吸附的气体。
（二）脱色温度对吸收度的影响准确量取5份50ml的复方秦皮提取液于锥形瓶，各加入0.2%的已预处理活性炭粉末，搅拌下脱色30分钟，温度分别调节为20、40、60、80、100˚C，脱色后抽滤除去活性炭，以蒸馏水为空白对照在349nm处测定吸收度[3]。
（三）脱色温度对提取液中有效成分的影响将（二）项下操作得到的五份提取液分别量取10ml，于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干。于80°C真空干燥箱干燥3小时，置干燥器中冷却0.5小时，得到干膏。精密加入甲醇50ml将干膏充分溶解，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液1ml置25ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，以甲醇为空白对照在349nm处分别测定其吸收度，计算秦皮乙素的含量。
（四）脱色时间对吸收度的影响准确量取7份50ml的复方秦皮提取液于锥形瓶，各加入0.2%的活性炭粉末，在60˚C搅拌脱色，时间分别设定为10、20、30、40、50、60、70分钟，脱色后抽滤，以蒸馏水为空白对照在349nm处测定吸收度。
（五）脱色时间对提取液中有效成分的影响将（四）项下操作得到的七份提取液分别量取10ml，按（四）项下操作，以甲醇为空白对照，在349nm处测定吸收度并计算秦皮乙素含量。
（六）活性炭浓度对吸收度的影响考虑到活性炭浓度过高对药物有效成分的吸附，依据有关文献，活性炭用于脱色的浓度适宜在0.1%～0.5%之间。准确量取5份50ml的复方秦皮提取液于锥形瓶，分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的活性炭粉末。在60˚C、20分钟条件下进行脱色，脱色后抽滤，以蒸馏水为空白对照在349nm处测定吸收度。
（七）活性炭浓度对提取液中有效成分的影响将（六）项下操作得到的五份提取液分别量取10ml，按（三）项下操作，以甲醇为空白对照，在349nm处测定吸收度并计算秦皮乙素含量。
（八）脱色温度对吸收度影响的测定结果
表1 脱色温度对吸收度影响的测定结果
脱色温度（˚C） 20 40 60 80 100
吸收度 2.048 1.968 1.944 1.859 1.950
（九）脱色温度对提取液中有效成分影响的测定结果
表2 脱色温度对提取液中有效成分的影响
脱色温度（˚C） 20 40 60 80 100
秦皮乙素含量（μg/ml） 22.965 21.569 22.470 21.303 20.376
（十）脱色时间对吸收度影响的测定结果
表3 脱色时间对吸收度影响的测定结果
脱色时间（分钟） 10 20 30 40 50 60 70
吸收度 1.871 1.807 1.837 1.824 1.830 1.833 1.834
（十一）脱色时间对提取液中有效成分影响的测定结果
表4 脱色时间对提取液中有效成分的影响
脱色时间
（分钟） 10 20 30 40 50 60 70
秦皮乙素含量（μg/ml） 23.282 22.953 22.052 22.102 22.064 22.115 22.153
（十二）活性炭浓度对吸收度影响的测定结果
表5 活性炭浓度对吸收度影响的测定结果
活性炭浓度（%） 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
吸收度 1.764 1.555 1.240 1.212 1.091
（十三）活性炭浓度对提取液中有效成分影响的测定结果
表6 活性炭浓度对提取液中有效成分的影响
活性炭浓度（%） 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
秦皮乙素含量（μg/ml） 18.968 17.153 18.702 15.656 15.897
四、讨论
1.在本实验中，我们采用医用活性炭对复方秦皮提取液进行了脱色工艺研究，研究对象包括脱色温度、脱色时间、脱色的活性炭浓度三个因素。在此基础上，对于每个因素，我们又采用了两个考察指标[4]，即吸收度和有效成分含量。通过吸收度和有效成分含量这两个指标，来综合考虑每个脱色因素的最佳条件。
2.首先，经过对脱色时最佳温度的实验考察，我们以温度为横坐标，吸收度为纵坐标，对考察结果作线形分析（附图1）。可以看出，随着温度的升高，吸收度逐渐降低，在80℃时提取液的吸收度达到最低。但是温度升高，提取液中的有效成分会不会受到影响，我们还不能肯定，所以还应该考察不同温度条件对有效成分含量的影响。以温度为横坐标，提取液中秦皮乙素的含量为纵坐标，对考察结果作线性分析（附图2）。此时，可以看出，当温度升高，提取液中秦皮乙素含量逐渐降低，当温度达到60℃时，秦皮乙素含量有所回升，之后继续降低。当温度达到80℃时，虽然此时吸收度较理想，但秦皮乙素的含量仅为21.303μg/ml，而60℃条件下秦皮乙素的含量为22.470μg/ml。同时，温度升高，液体的粘度减小，这样分子扩散加强，虽有利于吸附，但过高的温度对药液中热不稳定性物质不利。因此，在保证复方秦皮药材药效的前提下，我们选择脱色温度为60℃。其次，在脱色的最佳时间上，我们同样以温度为横坐标，吸收度为纵坐标，将结果作线性分析（附图3）。可以看出，吸收度在20分钟处降到最低，之后趋于平稳。因为提取液中活性炭的浓度一定，当达到一定时间时，活性炭的吸附作用处于饱和，不再吸附有色物质。这时考察其秦皮乙素的含量，以温度为横坐标，秦皮乙素含量为纵坐标（附图4）。当时间延长时，秦皮乙素含量逐渐降低，在10分钟处，秦皮乙素含量最高，但并不能达到最佳的脱色效果，药液的色泽与脱色前相比无明显变化。综合考虑，我们选择20分钟为脱色的最佳时间。最后，我们对脱色的最适活性炭浓度进行了研究，根据相关文献报道以及目前工业生产经验，脱色时使用的活性炭浓度一般控制在0.1%～0.5%。因此我们分别向药液中加入0.1%～0.5%的活性炭，以探索出最佳的活性炭浓度。以温度为横坐标，吸收度为纵坐标，对结果作线形分析（附图5），可以看出，吸收度随着活性炭浓度的升高而降低，因为活性炭浓度增大，对物质的吸附作用就相应增强。此时以温度为横坐标，秦皮乙素含量为纵坐标（附图6），作线性考察。可以看出，当活性炭浓度增高时，秦皮乙素含量并不与活性炭浓度成反比。当活性炭浓度为0.3%时，对提取液中秦皮乙素含量的吸附很少，这可能与活性炭的双向吸附有关，即活性炭在吸附溶液中有色物质的同时，亦吸附有效成分，而当活性炭浓度达到0.3%时，活性炭对二者的吸附趋于平衡，如果继续加大浓度，药液中的有效成分势必增大。因此，我们选择0.3%的活性炭进行脱色。
五、结论
我们通过对脱色温度、脱色时间、脱色的活性炭浓度进行研究，从实验结果可以看出，当温度为60℃、活性炭浓度为0.3%，脱色20分钟时，提取液可以达到理想的脱色效果。我们将提取液分为三批，在不同的时间，对脱色工艺进行了重复性考察，三次实验结论基本一致。而且其工艺操作简便易行，对目前的工业生产具有一定的指导作用。
图1 脱色温度对吸收度的影响 （略）
图2 脱色温度对提取液中有效成分的影响 （略）
图3 脱色时间对吸收度的影响（略）
图4 脱色时间对提取液中有效成分的影响（略）
图5 活性炭浓度对吸收度影响 （略）
图6 活性炭浓度对提取液中有效成分的影响（略）