奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

摘　要：为了解贵阳市某乳业有限公司奶牛场隐性乳房炎流行情况及其主要病原菌，采用CMT方法检出隐性乳房炎乳样后，对阳性乳样进行细菌分离与鉴定，同时对其主要病原菌进行了体外药敏试验。结果表明，该公司奶牛场隐性乳房炎的感染率为40%，主要病原菌为葡萄球菌属和链球菌属细菌，其敏感的抗菌药物有先锋V霉素、利福平、丙氟哌酸、氟哌酸、新霉素、卡那霉素、庆大霉素等，经临床用药观察，有效地控制了该公司奶牛场隐性乳房炎。

关键词：奶牛；隐性乳房炎；细菌；鉴定；药敏试验

奶牛乳房炎是指奶牛的乳房受到了物理、化学、微生物等因素刺激所引起的一种炎症，表现为乳汁发生理化性质和细胞学性质的变化、乳腺组织发生病理学变化等。该病是奶牛的常发病之一，可引起奶牛产奶量下降、奶品质降低、奶牛过早淘汰等^[1-2]。发病奶牛的乳汁含有病原微生物及其毒素、经治疗后的残留药物等，对人类健康危害极大^[3]。目前已知的奶牛乳房炎的致病性微生物已超过150种，其中包括球菌、杆菌、支原体、真菌、酵母菌和病毒等。大部分是由细菌感染引起的，主要由革兰氏阳性菌(如无乳链球菌、金黄色葡萄球菌)引起，规模化养殖场中革兰氏阴性菌(大肠埃希菌)感染也很普遍^[4]。

本试验对贵阳市某公司的几个奶牛场进行了隐性乳房炎普查、病原细菌分离鉴定和主要病原菌药敏试验，以期对该公司奶牛隐性乳房炎的防控提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

CMT检测试剂由贵州大学动物科学学院预防兽医学专业实验室提供；鲜血营养琼脂培养基、普通营养琼脂培养基、却甫曼琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、细菌生化微量鉴定管和药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2隐性乳房炎的普查

用CMT检测试剂对贵阳市某乳业有限公司2个奶牛场的1550头泌乳奶牛进行隐性乳房炎普查。收集奶样时，先用高锰酸钾清洗乳房，弃去头2把～3把奶，然后以无菌操作方法挤下约8 mL～10mL奶样于灭菌试管中。无菌取出2 mL～4 mL奶样进行CMT检测，阳性乳样标明牛号和日期后，随即带回实验室进行病原菌的分离鉴定。

1.3病原菌的分离鉴定

将隐性乳房炎阳性乳样摇匀后，无菌取适量的试管中部乳样，涂布于鲜血平板琼脂上，37 ℃培养24 h～48h，观察细菌的生长情况及其菌落特征。对不同形态的菌落进行挑菌纯培养后，涂片染色镜检。根据菌体形态和染色特性，初步判定细菌类属，然后分别进行培养特性和生理生化鉴定，如判定为葡萄球菌的需进行兔血浆凝固酶试验、过氧化氢酶试验、三糖铁试验、0/F试验等；如判定为链球菌的则需进行CAMP试验、溶血试验、七叶苷水解试验、美蓝牛乳试验、甘露醇、山梨醇、血清菊糖发酵试验等；判定为革蓝氏阴性杆菌的进行尿素酶试验、糖类发酵试验、枸橼酸盐利用试验、明胶液化试验等。

1.4主要病原菌的药敏试验

采用药敏纸片琼脂扩散法对主要病原菌进行药物敏感性试验，即将分离鉴定的主要病原菌分别均匀涂布于鲜血琼脂平板上，然后贴药敏纸片于其上，置37℃培养24 h～48 h，测量抑菌圈直径，进行抑菌效果判定。

2结果

2.1奶牛感染隐性乳房炎情况

该公司2个奶牛场共有奶牛2 500头，其中泌乳奶牛1550头，采用CMT检测试剂对其乳样进行隐性乳房炎的排查，结果显示阳性乳样620份(头)，阳性率为40%。

2.2隐性乳房炎细菌分离鉴定结果

随机选取隐性乳房炎阳性乳样70份，涂布在鲜血营养琼脂平板上，37 ℃培养24 h～48h后，结果每份乳样均有细菌菌落的存在，细菌检出率为100%。在琼脂平板上主要有3种不同的菌落：第1种是圆形光滑、湿润、边缘整齐、黄色或乳白色、中等大小的菌落，数量较多；第2种菌落与第1种特征类似，但呈现明显的β溶血现象；第3种为圆形、光滑，边缘整齐、灰白色、透明的小菌落。将上述微生物纯培养后，进行染色特性、培养特征和生化鉴定，结果见表1。

表1隐性乳房炎病原菌的分离鉴定结果

Table 1The isolation and identification results of pathogens in thecows with latent mastitis

病原菌 Pathogens	检出菌株数 The detection of strains	检出率/% Thedetectionrate
金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus	49	34.02
表皮葡萄球菌S.epidermidis	12	8.33
腐生葡萄球菌S.saprophyticus	10	6.94
微球菌 Micrococcus	5	3.47
无乳链球菌 Streptococcusagalactiae	15	10.42
停乳链球菌S.dysgalactiae	11	7.64
乳房链球菌 S.uberis	13	9.03
牛链球菌 S.bovis	4	2.78
粪链球菌 S.faecium	2	1.39
大肠埃希菌 Escherichiacoli	14	9.72
其他革兰氏阴性杆菌Other Gram-negative bacillus	6	4.17
其他革兰氏阳性杆菌Other Gram-positive bacillus	5	3.47
合计 Total	144	100

从表1中可看出，在70份隐性乳房炎阳性乳样中，共分离出细菌144株，其中革兰氏阳性球菌119株，占82.64%；革兰氏阴性菌和其他菌25株，占17.36%。在革兰氏阳性球菌中，金黄色葡萄球菌49株(34.02%)、无乳链球菌15株(10.42%)、停乳链球菌11株(7.64%)、乳房链球菌13株(9.03%)、表皮葡萄球菌12株(8.33%)、腐生葡萄球菌10株(6.94%)、微球菌5株(3.47%)、牛链球菌4株(2.78%)和粪链球菌2株(1.39%)。由此可见，引起该公司奶牛隐性乳房炎的主要致病菌为革兰氏阳性球菌，特别是葡萄球菌属的金黄色葡萄球菌。

2.2主要病原菌的药物敏感性

采用药敏纸片琼脂扩散法对主要病原菌进行药物敏感性试验，分析7种主要病原球菌对14种不同抗生素的敏感性(测量其抑菌圈直径)，根据杭州微生物试剂有限公司提供的标准进行抑菌效果判定，结果见表2。

药敏试验结果显示，对葡萄球菌属致病菌，氟哌酸、丙氟哌酸、先锋霉素V、利福平以及庆大霉素的抑菌效果较好，卡那霉素和新霉素亦有抑菌效果；对链球菌属致病菌，氟哌酸、丙氟哌酸、先锋霉素V、庆大霉素、卡那霉素和新霉素的抑菌效果较好，而其他抗生素的抑菌效果较差。

表2主要病原球菌的药敏试验结果

Table 2The results of drugsensitivity test of the main pathogens

抗菌药物	金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus	表皮葡萄球菌 S.epidermidis	腐生葡萄球菌 S.saprophyticus	无乳链球菌 Streptococcus agalactiae	停乳链球菌 S.dysgalactiae	乳房链球菌 S.uberis	微球菌 Micrococcus
直径/mm Diame- ter	敏感性 Sensi- tivity	直径 Diame- ter	敏感性 Sensi- tivity	直径 Diame- ter	敏感性 Sensi- tivity	直径 Diame- ter	敏感性 Sensi- tivity	直径 Diame- ter	敏感性 Sensi- tivity	直径 Diame- ter	敏感性 Sensi- tivity	直径 Diame- ter	敏感性 Sensi- tivity
青霉素 Benzylpenicillin	0	低Low	0	低 Low	12	低 Low	0	低 Low	0	低 Low	0	低 Low	0	低 Low
氨卞青霉素 Acillin	0	低Low	0	低 Low	0	低 Low	0	低 Low	12	低 Low	0	低 Low	0	低 Low
氟哌酸 Norfloxacin	24	高High	26	高High	25	高High	9	高High	22	高 High	22	高 High	24	高 High
丙氟哌酸 Ciprofloxacin	25	高High	26	高High	26	高High	21	高High	20	中 Middle	28	高 High	27	高 High
先锋霉素 Cephazolin	29	高High	37	高High	30	高High	30	高High	36	高 High	29	高 High	30	高 High
红霉素 Erythromycin	0	低Low	0	低Low	0	低 Low	0	低 Low	22	高 High	0	低 Low	0	低 Low
链霉素 Streptomycin	0	低Low	0	低Low	0	低 Low	0	低 Low	9	低 Low	0	低 Low	0	低 Low
庆大霉素 Gentamicin	20	高High	26	高High	14	中Middle	22	高High	18	高 High	17	高 High	17	高 High
卡那霉素 Kanamycin	0	低Low	26	高High	16	中Middle	25	高High	14	中 Middle	20	高 High	16	中 Middle
新霉素 Neomycin	20	高High	23	高High	0	低 Low	23	高High	19	高 High	20	高 High	0	低 Low
多黏菌素 Polymyxin	0	低Low	10	中Middle	0	低 Low	16	高High	0	低 Low	25	高 High	0	低 Low
四环素 Tetracycline	0	低Low	16	中Middle	12	低 Low	21	中Middle	10	低 Low	19	中Middle	12	低 Low
氯洁霉素 Clindamycin	0	低Low	20	高High	0	低 Low	0	低Low	16	中 Middle	22	高 High	0	低 Low

3讨论

乳房炎是危害奶牛业最为严重的疾病之一，其在世界范围内普遍存在^[5]。芬兰、挪威、瑞典每年因乳房炎问题淘汰的奶牛占淘汰奶牛的35%、19%和22%^[6]。法国、芬兰、瑞典、丹麦仅奶牛临床乳房炎发生率就分别达到20%、10.9%、1.1%、21%；日本奶牛乳房炎的平均发病率高达45.1%；我国奶牛乳房炎的发病情况更为严重，发病率一般在20%～75%，机械挤奶的奶牛场可高达79.7%^[7]。据世界奶牛协会统计，全世界20多亿头奶牛中，约有1/3泌乳奶牛患有不同类型的乳房炎，其中隐性乳房炎约占97%^[8-11]。由于隐性乳房炎缺乏明显的临床症状，常为人们所忽略。本试验采用CMT检测试剂对贵阳市某乳业有限公司奶牛场的泌乳奶牛进行隐性乳房炎调查，结果发现该公司隐性乳房炎的发病率为40%，比往年有明显的提高。分析其原因，可能是2008年初春，贵州省持续40d的低温条件，致使奶牛产生极强的寒冷应激，再加上饲料、饮水的匮乏等问题，导致奶牛的抵抗力下降，使大量的条件性致病菌有机可乘，从而引起该公司奶牛隐性乳房炎的暴发流行。经调查还发现，隐性乳房炎感染率的高低与饲养管理、环境卫生条件、病原菌致病力强弱等因素均有直接的关系。由此可见，加强奶牛饲养管理，保持环境卫生清洁，消除环境因素影响，提高奶牛免疫力，以预防和控制奶牛隐性乳房炎的发生与流行。

引起奶牛发生隐性乳房炎的病原细菌很多。本试验对贵阳市某公司奶牛场70份隐性乳房炎乳样进行细菌的分离鉴定，共检出144株，包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、表皮葡萄球菌和大肠埃希菌等，其中主要是革兰氏阳性球菌，与ReinosoE等^[12]报道的结果基本一致，说明隐性乳房炎致病菌中的细菌种类变化不大；个别地区出现的差异，可能与奶牛场的卫生条件和环境因素有关。

预防和控制奶牛隐性乳房炎，目前仍以抗生素投放为主。从本次药敏试验结果来看，丙氟哌酸、氟哌酸、利福平、先锋霉素V以及部分氨基糖苷类药物对隐性乳房炎主要致病菌具有良好的抑菌效果，而临床上常用的抗生素如青霉素类、链霉素等对病原菌己没有抗性。若在临床上使用头孢类和喹诺酮类抗生素来治疗奶牛隐性乳房炎，虽具有较好的抑菌效果，但价格昂贵，常给奶牛养殖场带来沉重的经济负担。因此，探索既经济又有效的治疗奶牛隐性乳房炎的方法已是迫在眉睫。