摘 要：猪流感是由猪流感病毒引起的一种呼吸道传染病。此病在世界各地都有发生，危害严重，经济损失巨大，并对人类的健康构成威胁。猪流感病毒属于正黏病毒科A型流感病毒属，病毒粒子呈多形态。该病毒对热、消毒剂敏感，对干燥和低温的抵抗力强。其分子特性为多节段的RNA病毒，由8个片段组成，分别编码10种蛋白质。猪流感病毒能够在多种动物的细胞和鸡胚增殖。病毒具有血凝活性，但不同毒株的抗原性无明显的区分。由于病毒受到抗体的压力很大，因此病毒的变异频繁，其机理涉及分子水平的抗原漂移和抗原转变。文章对病毒的理化性质、生物学特性、分子特性、病毒的蛋白和基因变异等方面的研究情况进行了综述。
关键词：猪流感病毒；生物学特性；病毒蛋白；基因重组
猪流行性感冒，简称猪流感(Swine influenza，SI)，是由正黏病毒科猪流感病毒(Swine influenzavirus，SIV)引起的猪的一种急性、高度接触性呼吸道传染病[1]。自美国1918年首次报道本病以来，欧、美、亚、非、澳等世界各大洲均有本病的发生和流行。SI能引起猪的高发病率(几乎100%)和低病死率(病死率≤1%)。此病的发生可使患病猪生产性能下降，推迟上市；还可引起呼吸道细菌和病毒继发或混合感染，使疫情更为严重，造成猪只死亡。同时，猪在禽-猪-人的流感种间传播过程中，起着中间宿主及多重宿主的作用[2]。猪是人源、禽源和猪源流感病毒的惟一共同易感宿主，它能将流感病毒传播给人或鸟类。通过监测SI的动态变化可以预测人流感的发展趋势。因此，研究SI具有更加深远的公共卫生学意义。由于本病的流行和危害日益严重，因此对SIV的研究已成为国内外兽医界、医学界和微生物学界的热点之一。
1 猪流感病毒的形态和大小特征
1.1 形态、大小和结构
SIV是多形性的有囊膜病毒，常为球形，直径80 nm～120nm，个别丝状体可长达数微米，它常见于刚分离到的病毒颗粒。病毒颗粒有3种蛋白突起，一种能凝集红细胞的蛋白突起称为血凝素(hemagglutinin，HA)，另一种能使病毒颗粒从凝集的红细胞表面释放下来的蛋白突起，称为神经氨酸酶(neuramidinase，NA)。HA和NA在囊膜上的比例约为4∶1～5∶1；膜上的第3种突起称为基质蛋白(matrixprotein，M),3种突起均以疏水性氨基酸锚定在类脂膜上。SIV结构可分为3层，最外层为双层类脂囊膜，它来自于复制的宿主细胞，中间层为基质蛋白1(M1)，形成一个或若干个球形蛋白壳，里层是核衣壳，呈螺旋型对称，直径9nm～15 nm，它含核蛋白(neucleoprotein，NP),3种多聚酶蛋白(polymerase protein1，PB1；polymerase protein 2，PB2；polymerase protein A)和病毒单链RNA。
1.2 理化特性
1.2.1 热稳定性 一般来说，SIV对热敏感，56 ℃ 30min灭活；灭活的顺序为，病毒颗粒的感染性、神经氨酸酶活性、红细胞凝集活性。病毒在4 ℃～40℃条件下不稳定，只能短暂保存，失去感染性；－10 ℃～－40 ℃保存两个月以上，常常使红细胞失去凝集活性；－70℃可保存数年，冷冻干燥后置4 ℃可长期保存。
1.2.2 pH的稳定件 pH 3.0以下或pH 10.0以上感染力很快被破坏；pH5.0左右能使SIV血凝素蛋白构型发生改变，其轻链HA2区溶血序列裸露，使红细胞发生溶解。
1.2.3 对紫外线的稳定性 SIV对紫外线敏感，可被灭活，但用紫外线灭活SIV能引起病毒的多重复活。
1.2.4 对化学试剂的稳定性 SIV为有囊膜病毒，故对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂均敏感，200 mL/L乙醚4℃过夜，病毒感染力被破坏；对氧化剂、卤素化合物、重金属、乙醇和甲醛也均敏感，10 g/L高锰酸钾、1 mL/L升汞处理3min,750 mL/L乙醇5 min，1 mL/L碘酊5 min,1 mL/L盐酸3 min和1 mL/L甲醛30min，SIV均可被灭活。
1.3 生物学特性
1.3.1 宿主范围 包括猪、人、火鸡等，试验条件下，可使小鼠、雪貂等感染发病[3]。
1.3.2 培养增殖 鸡胚是培养SIV最常用的材料之一，来源丰富，操作简便，易获得大量的SIV。但鸡胚易被鸡白血病病毒等污染。另外，用鸡胚分离或传代，SIV易发生抗原性变异。
1.3.3 细胞培养 SIV能在原代人胚肾、猴肾、牛肾、地鼠肾、鸡胚肾等组织细胞中生长。但当前应用最多的还是MDCK和MDBK细胞，由于二者都为传代细胞，均带有致癌基因，通过它们分离和培养的SIV无法用于疫苗生产，在SIV感染的组织细胞中，加入一定量的胰蛋白酶，可提高细胞病变程度，增加蚀斑数，加大蚀斑的直径，最重要的是能提高病毒产量。
1.3.4 毒性作用 SIV感染呼吸道黏膜上皮细胞，并在此增殖。如果把适量病毒注入易感动物皮下或肌肉内，病毒不能增殖，但注入者常伴有高热、浑身酸疼，白细胞减少等症状；在试验条件下，SIV可以使小鼠、雪貂等感染发病，主要引起肺炎症状；给小鼠脑内注射SIV还会引起中毒症状，24h内死亡。
1.3.5 红细胞凝集活性 SIV具有凝集红细胞的活性，可以凝集鸡、驴、猪、绵羊、兔、豚鼠、小鼠、大鼠和人“O”型血红细胞。并且这种活性可以被特异性抗体所抑制。
1.4 抗原性
根据表面和内部抗原，流感病毒科包括A、B、C型和托高土4个属。SIV属于A型流感病毒属。A型和B型病毒的内部抗原为核蛋白(NP)和基脂蛋白(M)，其性质很稳定，可用血清学方法区分。表面抗原为血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，容易变异。在A型流感病毒中各亚型之间交叉保护力弱，B型流感病毒的HA和NA不容易变异，且无亚型之分。据资料报道，国外也从猪群中分离到了C型SIV。SIV的抗原性较强，自然或人工感染的动物一般都能产生较高的中和抗体。SIV的表面糖蛋白HA和NA的抗原特性，尤其是HA蛋白的抗原性具有重要的意义。因为HA糖蛋白的抗原性直接影响病毒的感染性、致病性、宿主特异性、病毒在机体内的增殖传播及病毒的组织嗜性，它所产生的抗体能中和病毒感染。病毒逃避免疫系统的免疫识别所产生的抗原性变异，和它的抗原性及结构密切相关，抗原性改变的毒株常能引起新的流感大流行。
2 SIV的基因组结构
SIV是单股负链RNA病毒，基因组约13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。8个基因片段编码10个基因产物，其中片段1～3分别编码PA、PB1和PB2聚合酶，片段4和片段6分别编码HA和NA，片段5编码NP，片段7编码病毒基脂蛋白M1和离子通道蛋白M2，片段8编码非结构蛋白NS1、NS2。
3 SIV蛋白的研究
3.1 血凝素蛋白
HA是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，为杆球形蛋白分子，大小为4 μm×14 μm，在电镜下可形成星状聚合物。HA为75ku糖蛋白，是I型膜蛋白。流感病毒的HA包括3个高度保守的半胱氨酸残基，靠近HA2亚单位羧基端棕榈化位点。功能性HA是由3个非共价结合的HA1和HA2肽链所组成。
HA水解成HA1和HA2，是感染的先决条件，水解后则去除连接肽或单一精氨酸。这在不同的宿主细胞是不同的。因此，HA对细胞蛋白酶的易感性和这些酶在宿主组织中的分布是病毒泛嗜性的决定因素。
SIV进入宿主细胞依赖于病毒囊膜与细胞膜的融合。HA在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用。HA的膜融合作用除了需要蛋白酶的裂解外，还需要酸性环境。而这种融合作用是由于病毒HA在低pH诱导下变为具有融合活性的构象。罗汉松酸相关的复合物通过与A型流感病毒的中性pH构象相互作用，可以阻止低pH诱导HA变为融合性构象。胞浆域由10个～11个氨基酸组成，其中5个氨基酸残基在A型流感病毒的所有亚型中都是保守的。乙酰化位点的减少可阻止HA1亚型感染性病毒的形成。去乙酰化作用不影响膜的融合和融合孔的形成，但可抑制合胞体的形成[4-5]。
3.2 神经氨酸酶
NA也是流感病毒胞膜的糖蛋白。电镜下，NA突起为药10μm长的纤维，在其末端有一个大小不等的较大的结构，其分离物易形成花瓣样结构。每个NA突起为200ku，它是两个不同的由二硫键连接的55ku糖蛋白的二聚物，即由4个单体NA所组成，每个单体由一些折叠组成，排列成螺旋桨状，环绕着唾液酸结合位点。NA为Ⅱ型膜蛋白。NA在毒粒的胞膜上似蘑菇状，有一短柄，N端有一疏水区，它插入病毒颗粒的双层类脂膜，可能作为信号肽。NA是一种外切糖苷酶，可裂解唾液酸和附近的糖残基之间的糖苷键，使子代病毒释放出来，还可防止病毒之间的聚集。正是由于这一作用，0℃发生的血凝现象，在37 ℃就逐渐逆转，即在37℃，NA裂解了使病毒赖以组合的细胞膜受体。研究表明[6]，NA通过连接和隔离纤维蛋白酶原，提高这种泛在性蛋白酶前体的局部浓度，从而提高HA的裂解性。NA分子的这种不寻常功能的结构基础是C端的赖氨酸和146位氨基酸残基缺少一寡糖侧链。这些结果表明，对人类来说A型流感病毒(可能还有其他的一些病毒)都可以通过一种方式变为高致病性。
3.3 核蛋白
NP由病毒片段5编码，大约为500个氨基酸，具有型特异性，主要决定宿主范围。NP是螺旋形核衣壳的主轴，与RNA片段及各种聚合酶相连，在感染的细胞或病毒体中以磷酸化形式存在。NP至少有3个互相重叠的抗原区，其中一个区在各型流感病毒间均存在。针对这一区的单克隆抗体可抑制病毒RNA的转录，说明NP在mRNA到RNA转录过程中起着开关作用[7]。NP的核甘酸相对保守，但也可发生突变。
3.4 基脂蛋白
M为疏水性蛋白，富含精氨酸，其编码基因为片段7，具有3个读码框，由250个氨基酸组成，能诱导子代病毒的组装，具有型特异性抗原活性[8]。M1感染细胞的阶段不同，其作为结构蛋白所表现出的功能也有所差异。在成熟病毒中，病毒脱壳时，释放核糖核蛋白。在感染细胞中，M1则与核糖核蛋白结合，使其自细胞内转移到核外。M2由97个氨基酸组成，其核苷酸最保守[9]。M2为非糖基的跨膜蛋白，以四聚体形式组成寡聚体大量存在于感染细胞的表面，但在成熟病毒粒子内和囊膜表面含量很少。M2在感染细胞内作为质子通道，一方面控制高尔基体的pH，保证HA经过时的完整性：另一方面在病毒粒子脱壳时，形成酸化环境，激活HA的融合功能。M3由14个氨基酸组成，对其功能，目前还不清楚。
3.5 聚合酶蛋白
SIV的RNA聚合酶由PB1-PB2-PA3个亚单位构成，参与RNA基因组的转录和复制。亚单位PB1可与核苷酸底物相连，其功能是在病毒mRNA合成起始后使之逐渐延长；在模板RNA和病毒RNA的合成过程中也靠PB1的作用使合成链增长。PB1携带有RNA和DNA聚合酶的保守序列，PB1的SD序列对RNA的合成是必要的，PB1上还有两个核苷酸结合域。PB2在病毒mRNA转录的起始阶段，识别并结合在5′端Ⅰ型帽状结构；PB2的重要功能是作为一种核酸外切酶可特异性地裂解带帽的mRNA。PB2在体外可与Ⅰ型帽状结构的类似物以及没有PB2且缺少5′帽状结构的细胞合成的RNA相连，这些表明PB2对帽状结构的摄取是必要的。PA在病毒RNA转录和复制过程中，与PB1和PB2在一起随链的延长而移动，因此推测PA与PB1和PB2共同构成RNA聚合酶复合体。
3.6 非结构蛋白
NS有两个阅读框，分别编码NS1和NS2，分子质量为2.5万和1.2万。NS1是线性mRNA编码产物，有202个～207个氨基酸。NS2由剪接的mRNA转录而来，有121个氨基酸。序列分析表明，NS1和NS2有70个氨基酸重叠。NS1蛋白含有2个核定位信号区，其中34～38氨基酸高度保守，即Asp-Leu-Arg-Arg-；第2个信号区在203～207位氨基酸处。NS1主要存在于感染细胞的核内，而NS2存在于感染细胞内。NS1分子的氨基酸残基和磷酸基团共价连接，磷酸化的NS1蛋白可调节病毒复制过程。NS2和M1蛋白结合共存在于病毒体内，其具体的作用还不明确。
4 病毒的变异
SIV众多的血清型是其遗传变异频繁的有力证据，其机理涉及分子水平的抗原漂移和抗原转变。由于表面蛋白受到抗体的压力很大，编码它们的基因很容易发生变异。由于基因自发的点突变引起小幅度的变异，导致HA的改变积累到一定程度或HA正好使抗原决定簇改变，引起的抗原变异称为抗原漂移。SIV基因组中HA和NA的变异频率最高。每个核甘酸在复制周期中，HA的变异率可达2×10－3。抗原转变只限于A型流感病毒，是指大幅度的变异导致新的亚型出现。SIV的抗原变异的原因有两个方面，一方面是RNA聚合酶缺乏校正功能，病毒基因组复制时容易出现差错；另一方面是SIV的基因组是分散的，当不同的毒株同时感染同一细胞时，其核甘酸片段就有可能发生同源交换，从而导致抗原的改变[10]。
1998年从美国北卡罗来纳州分离到一株H3N2亚型SIV，其HA，NA和PB1基因为人型流感病毒基因，M，NP和NS基因为猪型流感病毒基因，PB2、PA基因为禽型流感病毒基因[10]。1978年，日本暴发的H1N2SIV是由H1N1和H3N2基因重组而产生的新亚型[11]。国内从山东猪分离出H9N2流感病毒，分析可能是由鸡和鸭流感病毒重组的结果[10]。继H9N2亚型流感病毒1998年首次从猪群中分离到，研究表明，通过进行部分序列分析发现，猪源H9N2亚型与国内分离的禽流感病毒高度同源。SI和人流感之间也可以发生交叉感染和传播。1978年，从台湾的一个猪群中分离到了H3N2亚型SIV，通过测序发现，此病毒发生了人流感病毒和SI病毒基因片段的重组[12]。
由于SIV受到的免疫压力较大，8个基因片段的氨基酸变化不断积累，其抗原变异明显。在孤立的地理环境中，SIV却可持续存在并保持相对的遗传稳定性[13-14]。
猪作为流感病毒的“混合器”，在流感病毒跨种属障碍而感染新宿主的过程中起着重要的作用。由于猪上皮细胞具有唾液酸2,6-半乳糖苷和唾液酸2,3-半乳糖苷，人流感病毒可与前者结合，而禽流感病毒与后者结合，因此，猪上皮细胞就能够被人流感病毒和禽流感病毒感染，而成为毒株间基因重组的活载体[15-16]。
由于SIV可直接感染人，导致人类患病或死亡，其公共卫生意义日渐显著。加强对SIV的研究，在减少世界经济损失和提高人类卫生健康方面，都具有深远的意义。