摘 要：为了建立区分疫苗株与广西分离株的检测方法，根据GenBank上的山羊痘病毒序列设计1对引物，用来扩增山羊痘病毒P32基因，通过对国内疫苗株及6株广西分离株的P32基因进行克隆、测序比较发现，所有广西分离株核苷酸651位的碱基全部由T变为C，647位～652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA，多了1个限制性内切酶Bsp1407Ⅰ位点，因此用特异性引物扩增出739 bp的目的片段后，再用限制性内切酶Bsp1407Ⅰ进行酶切分析，疫苗株可以切成135 bp和604 bp 3个片段，广西分离株可以切成135、226、378 bp3个片段。结果表明，所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗株和广西分离株。
关键词：山羊痘病毒；野毒株；疫苗株；聚合酶链反应限制性片段长度多态性检测法
山羊痘是由痘病毒科、山羊痘病毒引起山羊的一种急性、热性、接触性传染病[1]。该病严重地降低山羊的生产性能以及羊毛和羊皮的品质而造成养羊业的重大损失[2]，因此世界动物卫生组织(OIE)将山羊痘列为必须报告的动物疫病[3-4]，我国将其列为一类动物疫病[5]。本病主要流行于北非、中东、欧洲、亚洲及澳大利亚[1]，近年来国内屡见山羊痘暴发的报道[6]。
2003年初广西部分县市的山羊群中发生了一种急性、热性传染病，该病以皮肤和可视黏膜丘疹为主要特征，后经确诊为山羊痘。据统计，2003年广西山羊饲养量为3211 464头，有7个市发病，分布在35个县市，285个村，发病场所饲养山羊123 243只，其中8 192只发病，2459只死亡，发病率为6.65%，病死率为30.01%[7]，给广西养羊业造成重大经济损失。
Black D N、Hammond J M和Kitching R P用限制性内切酶HindⅢ对山羊痘疫苗株和田间野毒株进行分析发现，山羊痘病毒(GPV)野毒株与疫苗株氨基酸同源性为99.9%，全病毒只有7个开放性阅读框存在差异[8]。如此小的差异有利于疫苗株和野毒株发生重组变异，给疫苗的安全性带来极大的隐患。为了快速、准确的区分疫苗株与流行野毒株，本试验建立了聚合酶链反应限制性片段长度多态性
检测法(polymerase-chain-reaction-restriction-fragment-length-polymorphism，PCR-RFLP)方法，可在较短时间内准确区分疫苗株与野毒株，给山羊痘的防控工作提供了一定的科学依据。
1 材料与方法
1.1 山羊痘疫苗毒
山羊痘疫苗毒购自中牧实业有限公司。疑似病料采自广西各县市发病山羊皮肤痘斑及内脏。
1.2 主要试剂
饱和酚、氯仿、TaqDNA polymerase、d NTP、Marker、Gel Extraction MiniKit胶回收试剂盒、50×TAE缓冲液、pMD18-T载体、限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、Bsp1407Ⅰ等购自宝生物工程(大连)有限公司，Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。
1.3 引物
参考已发表的基因序列设计了4对引物，Orfu：5′-TCAAAAATGGCAGATATCCC-3′；Orfd：5′-CTCTCATTGGTGTTCGGATT-3′；Gu：5′-GGTCGCGAAATTTCAGATG-3′；Gd：5′-CAACTCTATTCCATATACCG-3′。其中Orfu和Orfd用来扩增山羊痘病毒P32基因全基因序列，扩增长度为1013 bp；Gu和Gd用来扩增山羊痘病毒P32基因部分序列，扩增长度为739 bp。
1.4 病料及疫苗株的处理
取痘斑1 g～2 g，研碎，用生理盐水5倍稀释，分装于1.5 mL离心管，－20 ℃保存；取山羊痘和羊口疮疫苗各1瓶，各加入3mL生理盐水，分装1.5 mL离心管，－20 ℃保存。
1.5 DNA的抽提
参照文献[9]进行。
1.6 山羊痘病毒P32基因的序列测定
用本试验设计的特异性引物扩增山羊痘病毒P32基因全基因，连接入pMD18-T载体，转化至感受态细胞DH5α，鉴定，阳性质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序，对序列测定结果用DNAStar软件进行分析。
1.7 PCR-RFLP方法的建立
用本研究所设计的特异性引物Gu/Gd扩增山羊痘病毒P32基因部分序列，然后用限制性内切酶Bsp1407Ⅰ对PCR产物进行分析。
2 结果
2.1 山羊痘病毒P32基因序列测定结果
将测得的序列上传至GenBank中，序列号分别是EF522176、EF522177、EF522178、EF522179、EF522180、EF522181。核苷酸序列比较结果见图1，在651位的核苷酸由T变为C,647位～652位为TGTACA，构成限制性内切酶Bsp1407Ⅰ酶切位点，而疫苗株和国际上其他分离株未发生变异。
图1 核苷酸序列测定结果
Fig.1 The detection of nucleotide sequences ofP32 gene of Capripoxvirus strains
2.2 疫苗株与广西分离株PCR-RFLP结果
2.2.1 PCR扩增结果 最佳扩增温度59 ℃，用特异性引物Gu/Gd扩增山羊痘广西分离株和疫苗株，可扩增出739bp的目的条带，与预期结果相符，结果见图2。
2.2.2 酶切分析结果 将2.2.1扩增的疫苗株及广西分离株用限制性内切酶Bsp1407Ⅰ37 ℃作用2 h后，用10 g/L的琼脂糖凝胶分析，可见疫苗株PCR产物被切成135 bp和604 bp2个片段，广西分离株PCR产物被切成135、226、378 bp 3个片段，与预期结果相符，结果见图3。
1～6.广西分离株S1～S6；7.疫苗株M.DNA标准DL 2 000
1-6.Guangxi isolates S1-S6；7.Vaccine strain；M.DNA Marker DL 2000
图2 GPV P32基因PCR扩增结果
Fig.2 Amplication ofP32 gene of GPV by PCR
M.DNA标准DL 2000；1.PCR扩增结果；2.疫苗株PCR-RFLP；3～8.广西分离株S1-S6PCR-RFLP；9.阴性对照
M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR amplication；2.Vaccinestrain；3-8.Guangxi isolates S1-S6；9.Negative control
图3 GPV P32基因PCR-RFLP分析结果
Fig.3 P32 gene of GPV anlysis by PCR-RFLP
3 讨论
限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymophism RFLP)是由BotstoinD等[10]于1950年提出的，是指由限制性酶切位点间的插入、缺失、重排或点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。该技术具有较强的稳定性，不受外界环境的影响，已广泛应用于疾病的诊断及病原的鉴定，具有较强的特异性和灵敏度。山羊痘的P32基因是GPV的囊膜蛋白基因，阅读框全长为969bp～975bp，编码323个～325个氨基酸，基因高度保守。本试验对国内使用的疫苗株和本实验室分离到的广西野毒株的P32基因的全基因进行了克隆测序及序列分析，广西分离株与现用的疫苗株相比在100位～105位缺失了6个碱基A，GenBank中已发表哈萨克斯坦的AY077835、NC004003，印度的AY382369、AY159333，中国哈尔滨的AY881707也见缺失，所有广西分离株651位的核苷酸均由T变为C，形成限制性内切酶Bsp1407Ⅰ，所有已发表的山羊痘分离株和广西分离株及疫苗株P32蛋白的核苷酸在268位～273位均形成限制性内切酶Bsp1407Ⅰ酶切位点，因此用限制性内切酶Bsp1407Ⅰ可以区分山羊痘广西分离株与疫苗株，本研究建立的PCR-RELP方法可将广西分离株切成135、226、378 bp3个片段，而国内使用的疫苗株与GenBank中的分离毒株可切成135 bp和604 bp2个片断。本试验建立的PCR-RFLP方法，可在6h内鉴别疫苗株与广西分离株，为山羊痘疫情的防控提供一定的科学依据，具有一定的临床应用价值。