徐引弟1,2，郭爱珍2，陈焕春2
(1.河南农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450002；2.华中农业大学农业微生物国家重点实验室，湖北武汉 430070)
摘 要：沙门菌是重要的人兽共患病病原，在医学、兽医学和公共卫生学上均具有十分重要的意义。最早用灭活苗来预防沙门菌病，逐步发展到基因工程减毒活疫苗，其中基因工程活疫苗经过不断的发展，逐步显示出其优越性。论文就沙门菌的疫苗的研究进展进行了综述。
关键词：沙门菌；基因工程减毒活疫苗
沙门菌属是肠杆菌科中的1个大属，包括2500多个血清型，主要寄生于人类及各种温血动物的肠道，引起各种类型的疾病，呈全球性分布。沙门菌是重要的人兽共患病原，引起人和动物的沙门菌病，表现为多种不同的临床反应。动物感染后主要引起败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症并使妊娠母畜流产，一定条件下导致急性流行性暴发，并且是人类食物中毒的主要病原之一，该菌在医学、兽医学和公共卫生学上均具有十分重要的意义。
最早用灭活的全菌疫苗来预防伤寒，由于灭活苗具有容易引起全身及局部反应、只能激发体液免疫、不能提供交叉保护、需多次加强免疫等缺点，此类疫苗的应用受到限制，不适用于公共卫生。近年来，应用各种基因工程方法构建沙门菌减毒株、研究毒力基因的功能和表达调控以及利用减毒沙门菌作为活载体表达外源抗原，研制多价疫苗等已成为该领域的研究热点。
1 经典的沙门菌疫苗
1.1 Vi荚膜多糖疫苗
最早被注册使用的伤寒沙门菌疫苗是Felix于1934年鉴定的伤寒Vi荚膜多聚糖。Vi荚膜多聚糖既是毒力因子也是保护性抗原，Vi特异性血清抗体是激活针对伤寒沙门菌的补体所必需的。非常多的报道显示，用荚膜多聚糖免疫可刺激产生针对伤寒沙门菌的保护性抗体反应，并且相当有效，在一些发展中国家特别是一些亚洲国家使用较多。然而接种这种疫苗会产生一些副作用。现已研究一些新的含有Vi多聚糖蛋白的伤寒疫苗，以期在初次和加强免疫后产生比Vi疫苗更高的抗体[14]。
1.2 化学诱变突变株
第二个注册的伤寒疫苗是致弱的伤寒沙门菌Ty21a，它是Germanier于1975年用化学诱变剂亚硝基胍诱变及紫外线照射诱导非定点突变得到的。Ty21a，在口服伤寒活菌苗的制备中发挥了开拓性作用。Ty21a具有galE突变，不能合成Vi荚膜抗原。galE编码UDP半乳糖4异构酶，缺失后不能完成UDP半乳糖与UDP葡萄糖的互换，而半乳糖残基是野生型伤寒杆菌光滑型LPSO抗原的重要成分，Ty21a在无半乳糖条件下为粗糙型，无免疫原性。Ty21a株是一种很有用的典型活菌苗，但它免疫后仅提供中等程度的保护作用，且接种者对菌苗配方及摄入剂量过于敏感[5]。另外，Ty21a也是报道用作外源基因表达的很好载体，在诱导伤寒沙门菌的同时，产生针对外源病原刺激的部分保护，如幽门螺杆菌、产肠毒素性大肠埃希菌、人乳头瘤病毒16型等[68]。
基于以上原因，迫切需要研制一种更加高效、遗传背景更明确的沙门菌减毒疫苗。
2 新型沙门菌减毒疫苗
随着对沙门菌毒力遗传以及重组DNA技术的深入了解，已经研制出许多遗传确定的新型弱毒伤寒株作为口服活疫苗的候选菌株，其中研究最广泛的是营养缺陷型弱毒株。
2.1 aro基因缺失株
aroA编码5烯醇丙酮酰莽草酸3磷酸合成酶，该酶催化2,4二羟基苯甲酸盐的分支酸途径的中间反应，产生芳香族氨基酸。而哺乳动物不具备该合成途径，故细菌从宿主体内获得这些化合物的可能性极小，使得aroA突变株在体外培养时依赖上述化合物生长，但在宿主体内只能有限生长繁殖从而得到减毒。LT2株的aroA突变株在猪上的试验表明与亲本株相比不能诱导IL1β、IL18、TNFα、IFNγ等炎性细胞因子产生，不引起回肠上皮细胞和肠系膜淋巴结的病理变化，对野毒的攻击不能产生保护[9]。
当aroA突变株得到野生型细菌DNA时，存在毒力回复突变的可能性。基于安全考虑，发展了2个～3个特定突变的沙门菌疫苗株。如构建了缺失一些参与嘌呤生物合成途径的一些基因的营养缺陷突变株。其中以purA基因的突变株研究较为广泛，purA基因编码腺苷酸合成酶，参与合成嘌呤的第一步IMP到AMP的转换。但是purA突变或purAaroA双突变的鼠伤寒沙门菌在小鼠上免疫原性很差。沙门菌的脂多糖LPS的内在毒性限制了沙门菌或疫苗的研制，将编码LPS中脂质A第2次酰基化所需的十四烷基转移酶的waaN基因缺失后，降低了LPS毒性有关的炎性细胞因子的诱导。aroAwaaN双突变的鼠伤寒沙门菌SK100与亲本aroA单突变株SL3261比，LPS的物理生物学特性都发生了改变，定殖、持续和对野毒攻击的保护方面是相同的，而且SK100表达破伤风毒素C片段(TetC)和疟疾子孢子蛋白是比亲本诱导更强的免疫反应，因此，aroAwaaN的突变为研制安全有效的多价沙门菌疫苗提供了重要的观点[10]。
作为aroApurA双突变株的替代品，已构建缺失其他莽草酸途径的基因如aroC(编码分支酸合成酶)或aroD(3脱氢奎尼酸酶)的缺失株，或与aroA缺失结合的双缺失减毒沙门菌。Hone构建了智利分离伤寒株ISP1820和实验室株Ty2的aroC和aroD的双缺失株CVD906和CVD908，突变株在低营养的培养基中不能复制，腹腔接种小鼠，aro单突变株和双突变株毒力均减弱[11]。在aroA缺失株基础上进一步缺失了与大肠埃希菌编码热激蛋白基因同源的htrA基因，htrA缺失后影响细菌抵抗巨噬细胞的氧化杀灭能力。htrA缺失结合aroA缺失，对小鼠是极好的口服疫苗，对小鼠的毒力不增强，缺陷是只有中等免疫力。因此，htrA和htrAaroA突变株可以作为抗沙门菌病很有潜力的口服疫苗[12]。
Tacket进一步将伤寒ISP1820和Ty2的aroC和aroD的双缺失株CVD908和CVD906的htrA缺失，构建CVD908htrA及CVD906htrA，缺失株在体外不能维持生长，在宿主组织中的存活能力受到严重影响，CVD908htrA可以作为传递外源抗原的活载体。CVD908htrA的Ⅱ期临床试验中，92%的低剂量和100%的高剂量受试者产生特异性伤寒LPS特异性IgA分泌细胞，46%～49%受试者检测到LPS特异性的IgG，大量的受试者有淋巴细胞增殖反应和IFNγ反应。突变株的副作用很小，因此鼠伤寒CVD908htrA株是很有前景的弱毒疫苗，正在对其进行进一步的临床试验。进一步用CVD908htrA持续表达Vi抗原，构建CVD909，目的在于促进CVD908htrA免疫株产生Vi抗体。小鼠鼻内接种CVD909，在诱导Vi抗体方面比CVD908htrA具有更好的免疫原性，对野毒的攻击的保护显著高于CVD908htrA。CVD909单剂量口服接种后能够诱导广泛的T细胞免疫反应，但是在32个志愿者中只有2位产生抗Vi抗体[13]。
2.2 cya/crp缺失株
cya和crp是研究非常深入的沙门菌毒力调节基因。cya编码环化腺苷酸合成酶，crp编码cAMP受体蛋白，cya和crp基因的突变株影响参与碳水化合物和氨基酸代谢的基因表达，和影响菌毛与鞭毛的表达。crpcya突变株能在普通培养基上生长，但由于crp缺失，消除了细菌在哺乳动物中摄取cAMP的惟一途径，因此在宿主体内不能转化成野生型菌株。cya和crp在染色体上相隔11min，所以2个基因恢复成野生型的可能性也很小。
Roy CurtissⅢ1987年用Tn10转座得到鼠伤寒沙门菌SR11株的crp与cya突变株，这些突变株对小鼠无毒性，但有免疫原性。Kelly于1992年用Tn10构建猪霍乱沙门菌x3246株的crp及cya突变株，对小鼠没有毒性，免疫后可保护1.6×104LD50的口服攻毒和80LD50的腹腔野毒攻击。同时发现临近crp基因的cdt(colonizationof deeptissues)基因与毒力有关，cya(crpcdt)19缺失株比crpcya双缺失、crp、cya、crp＋/cdt－单缺失株毒力更低，能更有效的保护野毒的攻击[14]。鼠伤寒沙门菌也引入了同样的突变，ZhangX等[15]报道，鼠伤寒沙门菌SL1344和UK1株的crp－、(crp－cdt)缺失株对小鼠均没有毒力，均能有效的定殖在肠相关淋巴组织(GALT)，但cdt缺失的菌株定殖在深层组织如脾脏、肝脏、血液的能力较cdt＋缺失株和野毒株明显降低。SL1344的crp＋cdt－、crp－cdt－缺失株免疫鼠对104LD50的SL1344的攻击产生完全保护。伤寒Ty2株的crpcya突变株x3927以5×104和6×105cfu接种受试者后，12个中有1个发热至40.1℃，每组6个中有1个发生菌血症，在x3927的基础上缺失cdt基因，构建Ty2株的cyacrpcdt三缺失株x4073，能适应105～109cfu接种量，没有发生菌血症和发烧情况，均能产生伤寒沙门菌特异性血清反应和特异性抗体分泌细胞[16]。将来源于鼠伤寒的P22转导鸡沙门菌构建crp基因缺失株，导致鸡沙门菌完全减毒，口服免疫10d后能完全保护野毒的攻击，所有生化影响除毒力外可以由来自鼠伤寒携带crp基因的质粒pSD110互补，crp缺失毒株可能成为针对鸡伤寒的候选疫苗[17]。将猪霍乱沙门菌crp缺失，同时缺失毒力质粒，构建S.C.Deltacrp/vpl()，高剂量免疫猪，体重增加没有明显变化，免疫妊娠母猪诱导高的母源抗体，保护仔猪感染沙门菌，疫苗株在仔猪上连续传代没有产生毒力返强，免疫仔猪外周血单核细胞体外产生T细胞增殖反应，免疫猪能产生针对外源毒株的攻击足够的免疫，因此该突变株为研制新型猪霍乱沙门菌活疫苗带来希望[18]。
国内徐引弟等利用我国广泛使用的猪霍乱化学致弱毒株C500，用重组自杀性质粒介导的接合转移法筛选无抗性的crp缺失株，表型发生变化，毒力降低，免疫原性影响不大。同时缺失asd(天冬氨酸β半乳糖脱氢酶)基因，构建宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因[19]。用所构建的平衡致死系统初步表达了绿色荧光蛋白gfp基因[20]。赵战勤等利用C500构建重组支气管波氏杆菌(Bb)，丝状血凝素fhaB基因F1段和百日咳杆菌黏附素prn基因P2段的重组沙门菌基因工程疫苗。口服和皮下注射免疫小鼠，均能产生高水平血清IgG，保护小鼠抵抗10LD50猪霍乱沙门菌强毒C781的攻击，但口服免疫不能提供对4LD50Bb的有效保护(4/22)，而皮下免疫能够提供完全保护(22/22)[21]。这些研究为深入研究研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株，及将C500开发为适于黏膜免疫的疫苗活载体的新型多价疫苗奠定了基础。
2.3 Dam和phoP/phoQ缺失株
沙门菌的Dam基因编码DNA腺苷酸甲基化酶，至少调节由PhoP激活的40种基因的表达，而phoP/phoQ基因编码转录激活因子/传感器激酶。Dam和phoP一起构成了一个交叉的长距离网络来调控沙门菌毒力，它可识别DNA亲链和子链，在甲基化指导的错配修复中起关键作用。缺失Dam基因时，细菌基因组突变率会增高，从而达到减毒的目的。Galan于1989年构建了鼠伤寒沙门菌SR11和SL1344的phoP突变株，小鼠能耐过腹腔或口服接种相当于亲本菌104LD50剂量的突变株，免疫小鼠能产生DTH反应，并抵抗104LD50强毒攻击。伤寒沙门菌Ty2的phoP/phoQ缺失株Ty800作为伤寒弱毒活疫苗在志愿者上进行了测试。证明Ty800是安全的，单剂量口服对人有很高的免疫原性，将Ty2的aroA缺失株进一步缺失phoP/phoQ，构建成Ty445，作为伤寒疫苗过分减毒，phoPphoQ的缺失明显降低毒力[22]。
2.4 SPI和Ⅲ型蛋白分泌系统相关基因缺失株
沙门菌致病岛(salmonella pathogenicityisland，SPI)是指沙门菌在进化过程中形成的、主要决定其致病作用的、且位于染色体上的至少由60个基因组成的长基因序列，包括SPI1、SPI2、SPI3、SPI4和SPI5等。决定沙门菌全部毒力的基因除一部分位于质粒上外，大多数由染色体上的致病岛编码。各岛上调节基因(phoP/phoQ、sirAL、sopE、lpf)的删除可使毒力大大降低。
2.5 其他减毒基因
随着对越来越多的沙门菌的全基因组的认识，越来越多的基因用于沙门菌的基因工程减毒，这里只简要举几例。
guaBA参与胍的合成。Pasetti获得Ty2的guaBA的缺失株CVD915，因guaBA的缺失而中断了鸟嘌呤核苷酸的生物合成。CVD915携带破伤风毒素C片段的原核和真核表达质粒经鼻内接种小鼠，激发高滴度针对C片段的IgG1、IgG2a和IgG2b抗体，当脾细胞暴露在伤寒沙门菌抗原和C片段后发生增殖反应，产生IL2、IFNγ。因此CVD915是携带原核和真核控制的外源基因的高效活载体，并能激发有效的免疫反应[23]。
ompR编码外膜蛋白R，ompR操纵子调控编码主要外膜蛋白ompC和ompF的表达。用p22转座突变鼠伤寒沙门菌SL1344主要外膜蛋白ompC、ompD、ompF和ompR，ompC或ompF突变株毒力与SL1344相同，ompD突变株毒力稍微降低，ompR突变株经口服或静脉免疫小鼠后表明已减毒，LD50降低105，能很好的保护SL1344的攻击[24]。
poxA编码丙酮酸氧化酶，Kaniga首次报道了poxA突变对细菌毒力有影响。poxA突变株表现为多效应表型，鼠伤寒沙门菌UK1的poxA突变株口服小鼠毒力比UK1减低104倍，静脉接种减低103倍，但仍能在脾、肠系膜淋巴结和PP结中定居，能诱导强烈的体液免疫反应，能对致死量的野毒攻击提供保护[25]。
3 理想的减毒疫苗
传统的灭活疫苗和亚单位疫苗虽然一直在沿用，但由于免疫效果不佳，免疫途径不方便而逐渐被活疫苗所取代。随着现代生物学和DNA重组技术的发展，以及对沙门菌毒力遗传学的深入研究和了解，为在该病原体基因组中引入多重、限定、减毒和不能回复的突变具备了可能性，这种突变是制备减毒活疫苗的遗传学基础。
与灭活疫苗、亚单位疫苗相比，减毒活疫苗具有高效、花费低、使用方便等优点。理想的活疫苗应具备下列条件：①完全减毒。②高度免疫原性。③不能回复突变。限定性多重性缺失突变可防止回复突变的发生。④对环境不造成污染。疫苗应在体内存留特定的时间，诱导免疫反应后被某种机制清除并不滞留于环境。⑤对后代无害，疫苗所诱导的保护性免疫应能传给下一代，而疫苗本身不应垂直传播。⑥经济且使用方便，诸如口服、鼻内途径较肌肉注射简单、方便。从以上的概述中可以看出，目前较为理想的伤寒减毒疫苗有CVD908htrA、x4072和Ty800等，但还需要进一步的临床试验。