摘 要：哺乳动物的卵泡闭锁是一种正常的繁殖生理过程，也是一种选择性的生理性细胞死亡过程。研究卵泡发育和闭锁对于提高动物繁殖力和胚胎工程发展有着相当重要的意义。本文主要在哺乳动物的卵泡闭锁与细胞凋亡、卵泡闭锁的调控因子、卵泡闭锁的相关基因以及卵泡闭锁的相关生殖激素等方面进行了综述。
关键字：卵泡闭锁 哺乳动物
卵泡闭锁（Follicular Atresia）是指卵泡发育到一定的阶段后停止发育并退化的现象。哺乳动物的卵泡闭锁是一种正常的繁殖生理过程。雌性哺乳动物在胚胎发育期，开始形成最早的原始卵泡，在出生前后双侧卵巢具有大量的卵泡，性成熟后大多数卵泡发生闭锁退化，只有少部分卵泡能发育成熟并排卵。卵泡发育的每一个阶段都可以发生闭锁，例如：人出生时的卵巢约有70～200万个卵泡，青春期开始时卵巢约有4万个卵泡，女性一生中能成熟排卵的只有约400个卵泡。卵泡闭锁是多因素参与的复杂调控过程。研究卵泡发育和闭锁对于提高动物繁殖力和胚胎工程发展有着十分重要的意义。在人类，将对抗生育、治疗不孕、提高妊娠率有一定的指导意义。本文将对哺乳动物卵泡闭锁研究进展作一阐述。
1 卵泡闭锁与细胞凋亡
在20世纪70年代，O’Shea等就指出羊卵泡内膜细胞在闭锁过程中发生核固缩、核破裂，然后进入卵泡液，最终被巨噬细胞吞噬。这与Kerr等描述的细胞凋亡的变化十分相似。Zeleznik等采用生化手段研究大鼠的颗粒细胞和黄体，首次指出卵巢内有凋亡特有的DNA阶梯。这些研究共同指出卵泡闭锁的实质就是卵泡中发生了细胞凋亡［1］。
细胞凋亡（apoptosis）是在一定的生理或病理条件下，通过基因调控、激活内源性核酸内切酶而发生的细胞自动消亡，自己结束其生命的过程，最后细胞脱落或裂解为若干凋亡小体，被其它细胞所吞噬，也称细胞程序化死亡(programmed cell death，PCD)。细胞凋亡是卵泡闭锁的主要机制，卵泡闭锁是一种选择性的生理性细胞死亡过程。
目前研究认为，多数动物胎儿的原始卵泡、初级卵泡闭锁主要是由卵母细胞凋亡引起，而成体主要是颗粒细胞凋亡引起。在卵泡发育后期，有腔卵泡及排卵前成熟卵泡的闭锁，卵泡中颗粒细胞先发生凋亡，随后引起卵泡中内膜细胞发生凋亡[2]。
卵泡闭锁在形态上出现一系列变化，主要表现为卵母细胞微绒毛（Mv）消失，染色体密集，核出现严重偏位、固缩成大团块，核碎裂成几部分；透明带玻璃化、增厚、膨胀、破裂；颗粒细胞松散、萎缩并脱落进入卵泡腔内；卵泡液被吸收，卵泡壁塌陷，卵泡膜内层细胞增大，成多角形，并被结缔组织分隔成团索状，分散在卵巢基质中，形成能分泌雌激素的间质腺。在卵泡闭锁过程中，原始卵泡退化的数量最多。闭锁的卵泡被周围的纤维细胞包围，通过吞噬作用最后消失而变成痕迹。
2 卵泡闭锁的调控因子
Cox认为，卵泡闭锁受多种卵泡存活因子和卵泡闭锁因子的调控，当前者处于优势地位，卵泡继续发育成熟并排卵；相反，当后者处优势地位时，卵泡就发生闭锁[3]。
EGF与TGF-α具有同源结构，EGF/TGF-α的受体具有酪蛋白激酶活性。生长因子与相应受体相结合，能活化受体本身的酷蛋白激酶，该激酶再磷酸化靶蛋白的酪氨酸残基。在牛、羊颗粒细胞上检测到它们的受体。在体外培养的颗粒细胞中，加入EGF、TGF-α能抑制颗粒自发凋亡，而酪氨酸激酶抑制剂能完全抑制以上生长因子的作用。卵泡中内膜细胞和颗粒细胞均能产生EGF，它是通过旁分泌和自分泌而发挥其抑制凋亡［4］。TGF-α也能刺激牛卵泡膜和颗粒细胞增生，但能抑制促性腺激素引起的分化，是通过旁分泌来影响的。也有试验证实，TGF－α可通过自分泌调节卵细胞闭锁[5]。
牛卵泡内膜细胞体外培养证明可以产生TGF-β，对颗粒细胞和内膜细胞的增生有抑制作用［6］，但可以增加卵巢受促性腺激素刺激的内固醇类合成［2］。TGF-β 既可以促进卵泡闭锁，又可以促进卵泡分化。TGF-α和TGF-β参与闭锁卵泡中内膜细胞清除，用TGF-α、TGF-β混合培养内膜细胞引起凋亡，只有其中一种将不会出现凋亡。
IGF-I和IGF-II是与胰岛素前体类似的单链多肽，IGF的表达在哺乳动物中不同的种间和组织间差异很大。IGF-I和IGF-II在动物卵巢内分别存在颗粒细胞和内膜细胞中，而在人的卵巢则相反[2]。IGF-I和促性腺激素互作促进了牛羊卵巢中卵泡的生长，在猪卵巢中，IGF-I结合FSH促进卵泡的增殖和分化，在体外培养的猪透明带细胞中，IGF-I促进了芳香化酶P450活性。P450负责雄激素（A）转化为雌二醇（E2）的酶。IGF-I协同LH调节内膜细胞产生A［7］。IGF-I能抑制大鼠颗粒细胞的凋亡。IGF-II和FSH调节颗粒细胞分泌E2。IGFs的最终作用是促进由FSH诱导的E2的产量和颗粒细胞的增殖，在生长卵泡中，颗粒细胞和内膜细胞内的所有反应都应同步并相互影响，只要其中任一地方发生变化都会导致卵泡闭锁。
类胰岛素生长因子结合蛋白（IGFBPs），也可称为类胰岛素生长因子抑制蛋白，其作用是抑制或降低IGFs的活性。IGFBP-2主要在正常健康卵泡中，在靠近基底膜的颗粒细胞比靠近窦及卵母细胞的颗粒细胞中表达要高。闭锁卵泡中，颗粒细胞内IGFBP-2、-5表达增强，而卵泡膜细胞中则是IGFBP-2、-4表达增强。早期闭锁卵泡，IGFBP-2、-5表达增强，而无 IGFBP-4表达。晚期闭锁卵泡中，IGFBP-2、5表达进一步增强，IGFBP-4亦表达，且IGFBP-2、-5的表达比IGFBP-4的表达要早[8]。卵泡闭锁时，IGFBP-2在闭锁卵泡液的浓度比正常卵泡高， IGFBP-2浓度与凋亡的颗粒细胞百分数呈相关关系，IGFBP-2有一定的调节作用。IGFBP-2在大小卵泡中含量不一，在小卵泡中含量高，且小卵泡闭锁的比率大。IGFBP-4在大、小卵泡中无变化。而IGFBP-5在大卵泡中的表达要低于小卵泡中。在人卵巢中，IGFBP-4仅存在颗粒细胞和内膜细胞中，闭锁卵泡中含高水平IGFBP-2和IGFBP-4被认为是抑制IGF－II的作用。牛发情优势卵泡闭锁主要是由IGFBPs积累和IGFs下降引起[9]。白细胞介素（IL－1）是一种抗卵泡闭锁因子，IL－1β调节咳嗽细胞产生IGFBP-4、-5。IL－1在卵泡闭锁中起重要作用[10]。
oFFR（ovarian follicular fluid peptide）主要存在于颗粒细胞中，抑制颗粒细胞黄体酮的分泌，且能诱导颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁，可能是通过对颗粒细胞的影响间接作用于卵母细胞[11]。
pRAS（ prorenin-reminangiotensin system）受控于促性腺激素，其表达从属于卵巢内因子的调节，正常健康的颗粒细胞中，pRAS可被颗粒细胞衍生因子抑制，从而阻止卵泡闭锁。而在闭锁颗粒细胞中，卵光膜衍生因子也许增强pRAS的表达，导致卵泡闭锁[12]。
组织型纤溶酶激活因子(tPA)蛋白介导的蛋白水解作用可能参与了卵母细胞的自身瓦解和清除过程。在很多中途发生闭锁的卵泡中，卵母细胞中tPA活性很高，而健康卵泡的卵母细胞则tPA活性很低。tPA与颗粒细胞中表达的抑制素α相互作用，可能对卵泡破裂、成熟卵子的释放和未成熟卵子的闭锁均起作用[13]。
采用体外培养，GDF-9主要引起细胞增殖[14]，卵泡抑制素与激活素结合可抑制体外培养的卵泡存活[15]。
PDCD5是由北京大学人类疾病基因研究中心克隆成功的新的凋亡相关蛋白，PDCD5参与了颗粒细胞的凋亡过程，是新的凋亡相关因子，也进一步说明了与颗粒细胞凋亡密切相关[16]。
3 卵泡闭锁相关基因
3.1 p53
它是一种受到广泛重视的抑癌基因。野生型p53可促进细胞凋亡的发生，具有阻止细胞由G1期向S期转变的功能，DNA的损伤可以引起p53蛋白表达增加，能够在DNA合成前修复其损伤，如果这种损伤加大，继续增加的p53蛋白则触发细胞凋亡。 p53诱导细胞凋亡的机制可能是：①p53能活化诱导细胞凋亡基因；②p53能活化与氧化还原作用相关基因；③产生活性氧；④氧化分解线粒体组分，使凋亡诱导因子从线粒体释放至胞质中，活化与细胞凋亡相关的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白激酶（caspases）。目前，已确定至少存在14种caspases，其中caspases-2、caspases-8、 caspases-9和 caspases-10 参与细胞凋亡起始，caspases-3 、caspases-6和 caspases-7则参与执行凋亡。在细胞中caspases均以无活性的酶原形式存在［4］。
3.2 bcl-2
它是B细胞淋巴瘤／白血病-2基因的缩写形式，bcl-2癌基因不同于其它的癌基因，它不是促进细胞增殖，而是延长细胞的生命期限，也即bcl-2通过阻断程序性细胞死亡信号传递系统的最后的共同通道而抑制程序性细胞死亡，从而促进细胞的存活，因而它是一种重要的细胞存活基因[17]。Bcl-2家族成员包括Bax、Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-xs等，它们对卵母细胞凋亡起重要作用．基因敲除法实验证明，Bax能引起卵泡发生闭锁，Bax基因在影响颗粒细胞调亡的过程中起决定作用[4]，若敲除bax，卵泡数量增加，说明生殖细胞凋亡受到抑制[18]；在敲除Bcl-2的小鼠体内，初级卵泡数量减少，若bcl-2过度表达，可导致出生后小鼠体内卵泡数目增加[19]，说明Bcl-2有促进细胞存活作用．此外，在线粒体中，Bcl-2与Bcl-xl形成聚合物，Bax与Bcl-xs 形成聚合物，两聚合物之间相互拮抗调节原始生殖细胞的存活和死亡[20]。
3.3 c-myc
它是一种原癌基因，c-myc基因的表达既能促进细胞的增殖，也能促进细胞凋亡。当某种因子存在，c-myc可以促进细胞大量增殖，反之则介导细胞进入凋亡状态［4］。c-myc蛋白在卵泡发育各阶段的表达，仅见于窦状卵泡细胞的颗粒细胞，提示c-myc蛋白在早期卵泡合成中可能参与启动原始卵泡的发育。另外，在晚期退化的黄体中，c-myc蛋白的免疫表达均局限于黄体中央瘢痕周围的黄体膜细胞，而在闭锁卵泡中，也仅在卵泡膜细胞表达，提示在黄体退化萎缩和卵泡闭锁的过程中，c-myc蛋白可能作为一种凋亡诱导的促进因素而起作用［21］。研究表明，棉酚可能通过c-myc介导细胞凋亡［4］。
3.4 Fas／FasL
fas是近年来发现与细胞凋亡极为密切的一种基因，Fas是fas基因表达的产物，是介导细胞凋亡的细胞膜表面蛋白，属于TNRF／神经生长因子受体（NGRF）家族成员，在人类颗粒细胞和黄体细胞的中均存在，以此种蛋白作为抗原的配体(FasL)在颗粒细胞中及有活性的T细胞中存在。Fas通过与FasL结合，可以介导细胞凋亡［22］。可溶性Fas配体(soluble FasL)即Fas是FasL存在于血清中的另一种形式，是Fas基因的受体产物，其作用是对抗在Fas／FasL中相互作用的膜Fas分子，因而被认为是凋亡的抑制因子。Kim研究发现p53介导的颗粒细胞凋亡过程中也有Fas／FasL系统的参与［23］ 。向成年大鼠注射抗 Fas多克隆抗体可促进卵泡闭锁及黄素化[24]。人的不同发育阶段，卵巢中Fas抗原的表达不同。婴幼儿只在原始卵泡、初级卵泡中的卵母细胞呈Fas抗原阳性，成熟期 Fas抗原表害随卵泡发育成熟而降低，绝经后卵巢中Fas抗原表达丰富，说明了Fas抗原通过凋亡过程参与了黄体退化及卵泡闭锁。Fas抗原通过启动卵泡闭锁而消极选择优势卵泡［25］。
3.5 WT-1
它是一种抑癌基因。Wlims肿瘤是儿童时期一种常见的肾细胞瘤，是Wlims肿瘤易感基因。卵巢、睾丸、子宫。肾脏是产生WT－1mRNA的主要器官，其中小鼠卵巢中颗粒细胞是WT－1mRNA最主要场所。WT－1在胚胎性腺发生中起关键作用。WT-1的功能可能是：协调p53基因发挥作用，增强p53基因在颗粒细胞中有作用；抑制几种编码生长因子及受体的转录功能，如：EGF、FGF、IGF－1等，直接下调这些促进细胞增殖的生长因子及受体的表达，将导致颗粒细胞凋亡，从而触发卵泡闭锁[4]。
3.6 ICE
其表达产物是白细胞介素1β转换酶，此酶是一种裂解蛋白质的蛋白水解酶，1993年，Yuan等发现ICE就是人体内与线虫自杀基因相当的自杀基因。两者氨基酸序列具有很高的同源性，其中由一段115个氨基酸区域同源性高达43％ ，这一区域正是ICE的功能结构域，这一区域修饰突变，则ICE失活。在体外，将ICE基因转染到颗粒细胞内，结果使细胞凋亡，bcl-2基因可以阻止ICE基因的作用，表明ICE对颗粒细胞有启动程序性细胞死亡的作用[26]。
另外，c—kit，它属于生长因子受体类的一种原癌基因。这种原癌基因的编码产物是一种受体酪氨酸激酶III家族的成员，与配子形成一些复杂的生物学功能有密切的关系[26]。在小鼠卵母细胞中，Kit与Kit配体之间相互作用可促进腔前卵泡的存活，即对卵母细胞的存活有促进作用[27]。
4 生殖激素与卵泡闭锁
生殖激素是卵巢卵泡细胞存活和凋亡的重要调节因子。近年来在理解卵泡启始闭锁的复杂的系列事件方面取得了很大进步。
目前研究认为GnRH促进卵巢卵泡颗粒细胞凋亡［28］。Hakan Billig等应用卵巢组织及颗粒细胞的DNA片段生化与原位检测。用GnRH衍生物处理大鼠，发现GnRH处理后增加了与180个碱基对成倍数的DNA裂解片段。这些被裂解的DNA特殊片段是细胞凋亡的一个特征，说明GnRH直接促进卵巢细胞凋亡。研究还发现GnRH诱发凋亡的作用对时间和剂量有依赖性，处理24h后可见其凋亡效果显著升高。在GnRH处理后的DNA片段方面，从颗粒细胞所分离到的DNA和从整个卵巢分离到的DNA研究相似，也证明是时间和剂量依赖性的，即凋亡在一定范围内随时间和剂量增加而加重。GnRH对DNA片段的作用是由卵巢GnRH受体调节的[29]。
GnRH可以通过与颗粒细胞上的受体结合直接诱导颗细胞凋亡而导致卵巢卵泡闭锁。但至于GnRH对性腺的直接促凋亡作用同其间接诱导卵巢卵泡发育之间如何协调，有待于进一步研究。目前，也有报道GnRH类似物可促使卵泡发育和排卵，抑制卵泡闭锁，降低颗粒细胞凋亡能力[30]。
促性腺激素FSH或LH可不同程度抑制卵泡颗粒细胞在缺乏激素培养的环境下发生凋亡，FSH抑制卵泡颗粒细胞凋亡的效应部分是通过IGF－1介导的[4]。Grieshaber N．A．等在研究中指出，FSH在排卵周期中对颗粒细胞分化和卵泡发育发挥极为重要的作用，颗粒细胞分化在细胞培养中的早期事件包括细胞形态学变化和细胞之间的相互反应。为了检查这些变化的原因和信号机制，他们检查生长在特定无血清培养基未成熟大鼠卵巢颗粒细胞系的FSH受体表达，发现当颗粒细胞暴露于FSH时最终分化，FSH撤退时发生凋亡［31］。体内注射马绒毛膜促性腺激素（eCG）能抑制颗粒细胞凋亡。
类固醇激素雌激素（E）可抑制早期窦状卵泡颗粒细胞和窦前卵泡颗粒细胞凋亡，且呈剂量依赖性，同进给予雄激素可抑制雌激素的抗凋亡效应。有研究认为雌激素抑制颗粒细胞凋亡的机制可能是它能抑制核酸内切酶的活性［4］。哺乳动物卵巢颗粒细胞内有孕激素（P）的特异受体。P4可以抑制颗粒细胞凋亡，孕酮拮抗剂RU486可以刺激卵泡闭锁和促进颗粒细胞凋亡［32］，哺乳动物A促进卵泡闭锁及颗粒细胞凋亡[28]。
IB是一种由卵巢细胞分泌的糖蛋白激素，IB对卵泡发育的影响与E相似，大卵泡的颗粒细胞分泌较多的IB，它主要抑制FSH的分泌，从而抑制其它小卵泡的发育［33］，在哺乳类动物中，IB的生理作用是促进颗粒细胞形成FSH的受体，使优势卵泡在低水平的FSH时仍能够维持FSH效应，而小卵泡则不能忍受低水平FSH而停止生长［30］。另外，生长激素（GH）能直接地通过IGF- I来抑制排卵前卵泡细胞凋亡和促进卵泡发育［28］。
5 卵泡闭锁的意义
研究卵泡的发育和闭锁机制可以为卵巢皮质组织的体外培养和卵母细胞体外成熟培养提供了理论依据。进一步完善超数排卵和活体采卵技术。
搞清人卵泡发育调控机制，将对抗生育，阐明某些与排卵障碍有关疾病的机理。为卵巢癌的化学药物和基因药物的开发提供更有力的理论根据。对提高辅助生殖助孕技术（ART）的妊娠率有一定的指导意义。
综上所述，卵泡闭锁是繁殖过程中正常发育的一部分，对动物繁殖保持一种动态平衡。雌性哺乳动物一开始产生数量巨大的生殖细胞，但又并非所有的卵母细胞都生来平等，卵母细胞凋亡可看作是遵循一种与达尔文进化论相类似的机制－适者生存。此外，卵泡闭锁还可清除受损和减数分裂异常细胞，减少异常卵子发育过程中的能量损耗[13]。卵泡闭锁的调节是多因素参的复杂过程，至今尚未完全搞清楚，需要进一步探讨。
