犬瘟热病毒融合蛋白七肽重复区基因的克隆表达

　　摘要：根据犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）融合蛋白（F）的基因序列，利用LearnCoilVMF与ExPASy软件预测出两个七肽重复区（heptad repeat，HR1与HR2），应用搭桥PCR拼接的方法获得HR1与HR2基因，将其直接克隆到pGEX6pI表达载体构建重组质粒，用PCR及双酶切方法鉴定阳性重组质粒，并对其进行测序鉴定。并在大肠杆菌中进行融合表达。

　　关键词:犬瘟热病毒；七肽重复区；搭桥克隆

　　生物膜的融合是许多生物学现象的核心，例如受精，囊泡运输，肌肉的发育以及病毒的感染等。迄今为止，这些膜融合现象中研究较清楚的是囊膜病毒的膜融合。囊膜病毒通过其囊膜糖蛋白介导的病毒囊膜和宿主细胞膜的融合来完成侵染过程。大多数囊膜蛋白的胞外区有一个靠近融合肽的七肽重复区（Heptad repeat，HR1或者Npeptide）和一个靠近跨膜区的七肽重复区（称为HR2或者Cpeptide），这两段序列与融合蛋白的构象密切相关，结构学研究表明这两段七肽重复区能够形成反相平行的六螺旋束结构，这被认为是融合蛋白融合后构象的核心结构。研究较多的有逆转录病毒、副黏病毒、正黏病毒等。

　　犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）是副黏病毒科麻疹病毒属的成员。CDV常引起急性、热性、高度接触性传染病，是当前对我国养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的病毒之一，可引起大批犬、貂、狐等动物发病，甚至虎、豹、猕猴、大熊猫也能发生感染，病死率30％～80％，经济损失惨重。本研究以犬瘟热病毒七肽重复区为研究对象，将进一步充实膜融合机制，并为抗病毒药物的开发奠定良好的理论基础。本文利用程序预测确定了CDV HR1 和HR2 区的氨基酸序列，用搭桥PCR的方法，扩增出犬瘟热病毒HR1 和HR2 基因，并利用大肠杆菌GST 融合表达系统进行了表达。

　　1  材料与方法 

　　1.1  菌种、质粒、工具酶和主要试剂  载体、JM109/BL21均为本实验室保存，工具酶和DNA回收试剂盒分别购自TaKaRa公司和博大泰克公司。CDV F蛋白的GenBank号为：NC001921。

　　1.2  利用LearnCoilVMF（http://learnCoilvmf.lcs.mit.edu/cgibin/vmf）与ExPASy（http://www.expasy.org/tools）软件数据库预测出犬瘟热病毒的七肽重复区。

　　1.3  引物设计  根据搭桥PCR方法设计引物，HR1与HR2分别设计4条引物，上游引物含BamHⅠ酶切位点，下游引物含XhoⅠ酶切位点，且下游引物酶切位点前设终止密码子。

　　1.4  基因拼接及其产物的纯化与回收

　　1.4.1  一轮PCR  设计的引物以40 pmol/μl的浓度分别溶于灭菌去离子水中，各取4 μl用作引物（引物互作模板）。

　　1.4.2  二轮PCR  第一轮产物加入1/10体积的3M NaAC，再加入3倍体积冰冷的无水乙醇混合，-20℃30 min，12 000 r/min离心10 min，再用75%乙醇洗涤，12 000r/min离心10 min，自然干燥后溶于10～20 μl的灭菌去离子水中。取1～2 μl作为PCR反应模板，以第一条及第四条引物为第二轮反应的上、下游引物进行PCR扩增。将第二轮PCR产物经琼脂糖电泳，切下目的带，玻璃奶纯化回收。

　　1.5  重组质粒的构建  将回收的目的片段和载体经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，T4连接酶连接构建重组质粒pGEX6p1/HR1、HR2，将其转化大肠杆菌JM109感受态细胞。用PCR及双酶切方法鉴定阳性重组质粒，并进行DNA测序确证。

　　1.6  GSTHR1、GSTHR2融合蛋白的表达  将DNA测序正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单菌落接入LB培养基中振荡培养，OD值0.8～1.0时加入IPTG终浓度1 mmol/L,30℃培养4 h，收集菌体，15％ SDSPAGE电泳鉴定。 

　　2  结果

　　2.1  LearncoilVMF与ExPASy软件数据库预测结果   LearnCoilVMF与ExPASy软件预测出犬瘟热病毒（CDV）的HR1与HR2的区域，两种方法预测的结果十分相近。本研究最终确定HR1的氨基酸序列为250～296，HR2氨基酸为569～602。具体序列为如下，加重处为HR区域的“a”位点，其以I/L氨基酸（疏水性氨基酸）为主，表明其为较典型的七肽重复结构。

　　2.2  引物设计

　　2.3  基因拼接与鉴定  一轮与二轮PCR扩增的目的条带如图3左图所示，重组质粒的酶切鉴定与PCR鉴定。此外，对两段基因测序的结果与设计的序列完全一致。

　　2.4  GSTHR1、GSTHR2融合蛋白的表达结果

　　3  讨论  囊膜病毒融合蛋白两个保守的七肽重复区HR1 和HR2 所形成的六螺旋束结构已被认为是融合蛋白在融合后构象的核心结构，这种结构特征在逆转录病毒（HIV1，SIV，HTLV1 和MoMLV）、副黏病毒（NDV，SV5 和HRSV）、正黏病毒（流感病毒）和丝状病毒（Ebola 病毒）得到证实。这说明这些病毒可能利用相似的融合机制［3～6］。本实验利用软件预测出犬瘟热病毒融合蛋白七肽重复区，应用基因拼接的方法成功的克隆了犬瘟热病毒融合蛋白的七肽重复区（HR1、HR2）。并在大肠杆菌中进行了表达。为下一步研究七肽重复区相互作用引致的病毒膜融合机制奠定了基础，并为抗病毒药物的开发奠定了理论基础。