摘 要：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是当前严重危害我国养猪业的重要传染病。PRRS的确诊依赖于实验室方法，包括检测抗原的病毒分离、免疫组化、免疫荧光、RT-PCR等方法，检测抗体的ELISA、血清病毒中和试验、间接免疫荧光、免疫过氧化酶单层试验等血清学方法。每种方法在诊断的敏感性、特异性以及成本方面存在差异，现有的血清学方法无法区分疫苗抗体和野毒抗体。正确的诊断结果取决于样品的种类、采样时间以及采样的代表性。PRRS确诊和结果的解释必须综合抗原抗体检测结果、流行病学资料、猪群疫苗应用情况等。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征;实验室诊断;抗原;抗体
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是世界范围内一种严重危害养猪业的传染病，也是目前我国规模化猪场的主要传染病[1]。临床症状表现为生产母猪的繁殖障碍以及呼吸道症状。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染后引起的病理及组织学变化往往不易与其他传染病区分，因此PRRS的确诊必须依赖于实验室手段。通过实验室方法，可以将PRRSV感染与猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪日本脑炎病毒、猪流感病毒、衣原体及钩端螺旋体等病原感染区别开。
1 PRRS诊断注意事项
只有采取正确的采样方法，选择合适的时机以及正确选择送检组织，才能得出准确的诊断结论。样品处理是PRRSV的分离检测能否成功的关键。用于病毒分离的样品应尽可能在发病早期采取，最好在发病开始7 d～10 d内，急性期样品病毒含量较高。无菌采取新鲜样品并立即送往实验室进行病毒分离。样品一般在4 ℃冷藏保存不超过2 d，较长时间保存则应在-70 ℃，不能长期置于-20 ℃，而且要避免反复冻融，样品运送过程中最好使用干冰。
此外，通过检测猪群血清的阳转或者测定PRRSV特异抗体滴度的上升，同样可以用于PRRSV感染的诊断。血清学结果判定之前应该了解猪群的发病历史以及疫苗应用历史。因为到目前为止，还没有一种血清学方法可以区分野毒抗体和疫苗抗体。另外，血清学方法也无法确定猪群感染的时间,只有将血清学结果与流行病学调查结合起来，才能做出准确的判断。当对某个猪群进行调查诊断时，必须对病原学检测结果与血清学结果综合分析，才能比较清楚的了解特定猪场PRRS的传播特点。
2 检测PRRSV的方法
2.1 病毒分离
PRRSV仅能在两类细胞上复制，即猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)和特定的非洲猴肾细胞（Vero细胞）[2-3]。但并非所有的PRRSV分离毒株都能同时在这两类细胞上复制，因此，在进行病毒分离时应该尽可能利用两类细胞，在分离欧洲型毒株时应尽量采用PAM。PRRSV可以从各种临床样品中分离到，包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺脏、淋巴结、胸腺、脾脏、心、脑、肝、睾丸、附睾、输精管、尿道球腺、阴茎组织、口咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、粪便以及精液中。一般来说，肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料，PRRSV在血清中要比在组织中稳定，但是老龄猪的病毒血症可能是一过性的，这时组织中分离到病毒的可能性要大一些。送检材料通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及淋巴结。对急性感染猪，血清、肺脏以及支气管肺泡灌洗液较为合适。对于持续性感染猪，扁桃体、口咽拭子以及支气管肺泡灌洗液比血清和肺脏更合适。对于晚期流产以及早产猪，吸初乳前的弱仔样品比木乃伊胎、流产或死胎样品病毒分离的效果好。感染仔猪群中，弱仔病毒血症的可能性最大，但应注意高滴度的母源抗体对病毒分离有干扰作用。
2.2 病毒或抗原的检测方法
冰冻切片免疫荧光抗体试验(IFA)以及免疫组化试验(IHC)可以检测组织中的PRRSV抗原。冰冻切片直接FA试验成本较低并且快速，这两种方法的特异性很高，但相对来说敏感性不够。样品的质量对FA结果影响非常大，要求组织应该新鲜。IHC可以检测甲醛固定的组织，比FA的敏感性要高，但更费时而且成本更高。通过组织病理学切片，结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。直接FA试验可以检测新鲜样品或冷冻样品，用于IHC的组织应在100 mL/L中性缓冲甲醛中固定，组织样品最好采集心、肾、肺、淋巴结、脾脏、胸腺以及扁桃体。
2.3 分子生物学方法
PCR直接检测临床样品中PRRSV的基因组RNA，省去了病毒分离的过程，所以比病毒分离省时，敏感性要高于病毒分离，特异性也非常高[4]。用于PCR检测的样品包括血清、精液、肺组织以及胎儿。PCR方法可以在较短时间内得到结果(24 h～48 h)。目前，PCR方法已被广泛应用于临床样品的检测，检测的目标通常是针对PRRSV基因组ORF7,ORF6或ORF1b[5-6]，另外，也有报道采用更为敏感的套式PCR方法检测PRRSV，实时定量荧光PCR方法也已经用于检测临床样品[7-8]，这些方法比常规PCR特异性更高，但是需要更高的成本，因此在实用性方面不利于推广。PCR方法在PRRS诊断以及群体监测上可以发挥很大作用，比如用于后备种猪的筛选，持续性感染猪的诊断以及用于猪群的净化工作，例如在美国采用PCR结合ELISA方法对猪群PRRSV感染进行“检测和清除”计划，已经在部分血清阳性率较低的猪场取得较好效果[9-10]。
需要注意的是，不同的实验室由于送检病料的新鲜程度、病料处理方法、实验室的设备条件以及操作人员的技术与经验存在差异，所得到的结果也有可能不同。因此，在对临床样品进行RT-PCR检测时需要对送检者做相关说明，在对结果进行分析时也应该慎重，通常需要同时综合考虑其他方法。
3 血清抗体的检测方法
直接免疫荧光抗体试验(IFA)，血清病毒中和试验(SVN)、免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法都可用于测定PRRSV的特异性抗体。IFA用于检测单个发病猪的特异性最高(99.5%)[11]，并且能测定血清抗体的滴度，根据稀释方法的不同，血清抗体滴度为16或20可判定为阳性，IFA检测感染后2个月～3个月内的特异抗体可信度较高。同样，IPMA比ELISA的敏感性更高，特异性也非常好，IPMA方法可以在PRRSV感染后7 d～15 d内能检测到抗体[2]。与IFA类似，IPMA方法可以准确检测感染后2个月～3个月内的特异性抗体，实验毒株与感染野毒株的相关性可能对IPMA试验的结果有影响。ELISA方法的敏感性和特异性也较高[12]，ELISA方法通常包括间接ELISA(通过样品与阳性对照的比值(S/P)判定结果)以及阻断ELISA。与其他方法相比，商品化的ELISA试剂盒由于生产以及实验操作的标准化和程序化，因而结果的一致性相对较高，同时，ELISA方法可在较短时间内得到结果，因此很多国家都将其列为法定或标准的操作方法，例如IDEXX公司新的ELISA试剂盒(HerdChek 2XR)检测在疫苗免疫后4周～6周血清阳转达到高峰，峰值约为2.5～3.5 S/P[13]。
SVN试验特异性也非常高，但比IFA及ELISA的敏感性要低[14]，可能是由于PRRSV特异的中和抗体要在感染后1个月～2个月才能检测到[15]，一般来说滴度≥4判定为阳性。SVN试验通常用于科研工作中，在生产实践中采用血清中和试验太费时费力，同时实验结果往往受实验毒株和感染毒株相关性的影响。
近几年国内学者也建立了PRRSV重组M或N蛋白乳胶凝集试验用于PRRSV抗体监测，为临床应用提供了简便快速的检测方法，据报道，该方法与IDEXX公司的ELISA试剂盒的符合率分别达到87%或78%[16-17]。
4 血清学结果的分析
通过实验室方法得到猪群的血清学监测结果后，科学的分析是非常重要的环节，只有合理的分析结果，才能对生产及疾病控制起指导作用。PRRSV的特异抗体通常不能在猪体内持续终身。在实验感染条件下，通过IgG-IFA、IPMA、ELISA、SVN方法可分别在感染后5 d~9 d，9 d~11 d，9 d~13 d和9 d~28 d内检测到抗体。PRRSV特异 IgM抗体在接种后5 d可以检测到，并可持续21 d~28 d[18]。不同的方法所检测抗体峰值时间各不相同，IFA 30 d~50 d，IPMA 35 d~50 d，ELISA 30 d~50 d和SVN 60 d~90 d，随后抗体滴度逐渐下降。感染PRRSV后各种方法检测抗体的消失时间，IFA 4个月～5个月，ELISA 4个月~10个月以上，IPMA 11个月～12个月，SVN 12个月。接种弱毒疫苗后各种检测方法的结果与上述时间段相当。
从疑似PRRS的单个猪体采集的血样检测为阳性，不能轻易做出确切的诊断结论。血清学阳性的结果并不能肯定PRRSV是否能引起临床发病，阳性结果可能源自母源抗体，有报道母源抗体可在出生后4 d检测到并可持续约3周，但也有报道母源抗体持续4周～10周，最长的报道有16周[19]。由于IFA和ELISA抗体持续时间较短，因此在检测猪群的感染状况时，应当选择青年猪，对于猪场来说，从分娩到育成猪群中PRRSV感染引起的血清阳转率通常在育成猪阶段最高。
PRRS血清学呈阴性有几种可能性，即可能未感染PRRSV或者感染但还未产生抗体，或以前感染过但现在血清转阴，还有可能是检测方法的敏感性不够或操作误差引起，因此，对于单份血清样品的判断应该非常慎重。目前已有的血清学方法更适合于整个猪群的群体监测，而不能对单个个体进行诊断，只有通过双份血清滴度改变以及临床和病理学变化，才可以对PRRS做出初步诊断，更准确的诊断还应与病毒分离或抗原检测手段结合起来。
5 鉴别诊断
随着PRRSV感染所造成的危害受到越来越多的关注以及疫苗的广泛应用，PRRSV的鉴别诊断是值得考虑的课题。虽然现有的血清学方法并不能区分疫苗抗体和野毒抗体，但有些方法可以对毒株进行鉴别，如单抗可以区分美洲株和欧洲株，此外，单抗也可以区分商业化的弱毒疫苗株和野毒株。采用分子生物学方法如PCR、RFLP以及DNA序列测定，可以对PRRS病毒分离株进一步分析。
PCR方法可以区分欧洲株与美洲株[20],但其临床应用意义并不大。RFLP只能对不同的分离毒株进行大致分类，由于RFLP与病毒毒力以及抗原的相关性并无关联，仅代表部分病毒基因组序列，因此在临床上的意义也不显著[21]。序列测定可以在分子水平上分析不同毒株间的相关性，直接了解核苷酸的插入、缺失或突变等变化，因而可以分析在一定时段内病毒在猪群间传播的背景，而且序列测定可以有助于区分疫苗毒株和野毒株，绘制不同猪群分离毒株的进化树。很多报道表明了PRRSV分离毒株间基因水平上的多样性[22-23]，提示PRRSV在一定时段内快速进化，但是在实验条件下，继代的PRRSV与原毒株间序列的差异不到1%，相反，野毒分离株间序列的差异往往达到15%以上。因此，如果两个毒株间的序列差异大于0.5%~1%，则认为毒株间并无明显的亲缘关系。虽然序列测定是分析毒株间相关性的最好方法，但有些问题如毒株的来源、致病性、生物学特性等疑问并不能通过序列测定得到合理的解释。因此，如果分离株与疫苗株间有较大的相似性，也不能预测疫苗的效果或根据序列结果来筛选疫苗毒株。
总之，PRRS给当前养猪业造成严重的危害，通过实验室方法对PRRS进行确诊以及监测是防控该病的重要环节，在临床应用过程中，必须充分考虑每种诊断方法的优点及局限性，综合抗原抗体检测结果并结合流行病学资料和猪群疫苗应用历史，才能了解猪群的PRRS实际流行状况，从而采取针对性措施。
