限于国内现有条件，经研究确定新兽药特殊毒性试验（“三致试验”）一般只进行致突变试验和致畸试验。在致突发试验中，考虑到检测终点应有原核细胞和真核细胞，基因突变和染色体畸变，体内和体外试验系统，体细胞和生殖细胞之分，确定Ames试验和微核试验为必做试验。精子畸形、睾丸精原细胞染色体畸变、显性致死三者可以任选一项，若前二者任一项为阳性均必做显性致死试验。这样，在致突变试验中必须至少做三项试验。在致畸试验中，对一般兽药来说，传统致畸试验为必做试验；对饲料药物添加剂还应增加养致畸试验，喂养繁殖毒性试验。喂养繁殖毒性试验一般只做一代繁殖毒性，一代为阳性时应再做第二代繁殖毒性，即：
各项试验方法如后：
一、艾母氏（Ames）试验方法
1、菌种
组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102四个标准株。
2、菌种鉴定
以上菌种需分别作抗氨苄、抗四环素、抗紫外、结晶紫、组氨酸需求、自发回变数的鉴定。
3、剂量分组
每次试验要求4～5个剂量组，每个剂量做三个平行平皿。高剂量以不抑菌为原则。液态受检物的剂量从0.05～50μl/皿之间选择，固态受检物从0.1～1000.0μg/皿之间选择，最高剂量可达5000.0μg/皿。选定后的剂量应配制成适当浓度，使每皿加入受检物的体积为100μl或200μl。
4、溶剂
一般以水为溶剂，选用其他溶剂需说明理由。
5、对照物
每次检测要求同时作阳性和阴性对照；用已知的阳性物作阳性对照，用溶剂作阴性对照。加S9混合液时要同时作不加S9混合液的对照平皿。
6、S9制备
选体重200克左右成年雄性大鼠，经诱导剂诱导后宰杀，处死前12小时禁食。在低温条件下，无菌操作取出肝脏，用KCI液淋洗后置匀浆器中制成匀浆。低温离心后分装，保存于液氮或-80℃冰箱中。制得的S9需作S9活力测定。
7、试验步骤
将经鉴定合格的TA97a、TA98、TA100和TA102菌株分别接种于增菌培养液中。37℃水浴振荡培养，每毫升活菌数不得少于1～2×109。
受检物，包括对照物，按设计剂量配制。取受检物0.1～0.2ml，菌液0.1ml，S9混合液0.5ml或磷酸缓冲液0.5ml，依次加入无菌小试管中，37℃水浴振荡培养20分钟后（也可采用平板掺入法），加入45℃顶层培养基2.0ml，混匀倒入含底层培养基的平皿上，37℃培养48小时。
8、结果评价
在计数菌落前应先观察背景菌苔的生长情况，正常的背景菌苔应呈均匀的砂粒状。受试组与阴性对照组的背景菌苔应一致，阴性对照组的自发回数应在正常值之内。
受试组的菌落数大于2倍自发回变数，并有剂量反应关系和重现性，判为诱变阳性。
二、微核试验
1、动物
选择成年健康小鼠（应注明品系），将小鼠随机分为受试组和对照组。每组动物数不少于10只（雌、雄各半）或至少6只雄性动物。
2、受试物的处理
将受试物溶于适宜的溶剂中，以0.1～0.2ml/10g体重的给药体积配制成适当的浓度。
3、给药方式
原则上采用与推荐临床使用相同的给药途径，内服时应用灌胃法。给药剂量以LD50为依据，设3个剂量组。高剂量组应出现毒性反应，一般可采用LD50的0.8～0.5；低剂量组的给药量为LD50的0.05～0.10。
每次试验应同时设阴性对照组和阳性对照组，阳性对照物可选用已知的能诱发微核阳性的诱变剂。
４、试验操作
一次给药一般在24，48，72小时取样制片。或二次给药，从第二次给药后的6，24小时取样制片。处死小鼠取骨髓，将骨髓洗入离心管中，离心。常规涂片。姬姆萨染色，镜检。
5、镜检
采用双盲法计数分析，每只小鼠在同一张片子上计数1000个嗜多染红细胞，同时计数嗜多染红细胞（PCE）同正染红细胞（NCE）之比。必要时，亦可采用吖啶橙染色，荧光显微镜分析计数。
6、结果评价
将数据列表，分别列出嗜多染红细胞数，微核数及PCE/NCE之比。所得结果用t检验进行数据分析，经重复试验P<0.01并有剂量反应关系时，判为阳性。
三、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
１、细胞
采用中国仓鼠卵巢细胞系CHO，染色体数目21。或中国仓鼠肺细胞系CHL，染色体数目25。
2、细胞培养
使用MEN-Eagle’s培养基或1640培养基，配制完全培养液，加15％灭活的小牛血清，100IU/ml青霉素，调节PH7.2～7.4。进行常规单层细胞培养。在细胞处于指数生长期时用胰酶-EDTA液处理，并自培养瓶表面将细胞洗脱下来。计数每毫升培养液含有的细胞数。在含有10ml培养液的25cm2的培养瓶中加2～5×105个细胞。在37℃，湿度95%，5%CO2培养箱中培养过夜。
3、试验分组与剂量
试验分3个受试组，另设阴性和阳性对照组。高剂量组以50%细胞生长抑制浓度为准，否则应说明理由。低剂量组接近于阴性对照组细胞成活率。各组均需有加S9和不加S9试验。
4、试验操作
向经过夜培养的培养瓶中依次加入S9，受试物或对照物。培养18～22小时。在细胞收获前2～4小时，加秋水仙素，使最终浓度为每毫升培养液0.1μg，胰酶洗脱后加入含小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用。0.075mol氯化钾溶液低渗处理，甲醇：冰醋酸液固定，离心，取混匀沉淀舞常规制片，姬母萨染色。镜检分析。
5、结果评价
采用双盲法镜检分析。每个剂量组的两个培养物至少各分析100个中期相细胞。将数据列表，分别列出数目畸变和结构畸变数，所得结果用t检验进行数据分析。经重复试验P<0.01，并有剂量反应关系时为染色体畸变阳性。
四、显性致死试验
1、动物
一般用大白鼠，也可用小白鼠。为保证试验结果的重现性，应用近交系或近交系之间杂交的F1代。雌、雄鼠不能来自同一杂交群。所有试验动物都应达到性成熟，雌鼠应未交配过。
2、剂量
应设三个剂量组，一个阳性和一个阴性对照组。每组用雄鼠10只。高剂量应导致毒性症状，明显降低繁殖率，约为LD50的1/10。低剂量为LD50的1/100。
3、给药方式
原则上采用与推荐临床使用相同的给药途径，内服时应用灌胃法。受试物应连续给药5天，每天一次。
4、交配方法
在最后一次给药的当天，将雄鼠与雌鼠按1：2同笼，第5天取出雌鼠，间隔2天后再防入新的雌鼠。如此需要连续8～12周（大鼠）或6～8周（小鼠）。查出阴栓的当天为妊娠第0天，未查出者以同笼第4天为妊娠第0天。
5、胎仔检查
雌鼠必须在妊娠后第13天（大鼠）或第12天（小鼠）处死，剖腹，检查两侧子宫角的着床数，早期死胎，晚期死胎及活胎数。每制雌鼠分别记录。
6、结果评价
以显性致死率DL（%）表示。
试验组妊娠鼠的平均生存胎仔数
DL（%）= ———————————————————×100%
阴性对照组妊娠鼠的平均生存胎仔数
如果死亡胎仔数增加，胚胎着床数减少，未着床胚胎数增加，生存胎仔总数减少，这些结果具有统计学意义并有剂量反应关系时记为阳性显性致死反应。
五、精子畸形试验
1、动物
选用8～10周龄成年雄性小鼠（注明品系来源）。标本采集时每组动物为5只。
2、剂量与分组
试验组至少设高、中、低3种剂量，同时设阴性和阳性对照组。高剂量组的总剂量为4～2LD50；低剂量组的总剂量为0.5～1LD50。
3、给药方式
原则上采用与推荐临床使用相同的给药途径，内服时应用灌胃法。每天给药一次，连续5天。
4、制片
于第一次给药后35天，将小鼠处死，取出两侧附睾，在生理盐水中剪碎，搅拌、过滤；常规涂片，甲醇固定，伊红染色。
5、镜检
高倍镜下每只小鼠检查完整的精子200～500个，每一剂量组至少检查1000个精子，查看精子畸形数及畸形类型。
6、结果评价
将试验组的精子畸形百分率与对照组作统计学处理，经重复试验P<0.01，并有剂量反应关系时，判为阳性。
六、繁殖试验
1、动物
一般选断乳大鼠，也可用家兔，所用动物应注明品系。
2、剂量与分组
试验设3个剂量组，1个空白对照组。高剂量应使亲代动物出现轻微中毒（不能有死亡）；低剂量应不引起可观察到的毒性作用。也可按亚慢性试验的剂量给予受试物。大鼠每组雌鼠20只，雄鼠10只。家兔每组雌雄各12只。
3、给药方式
混饲或饮水。
4、试验操作
大鼠断乳后开始饲喂含受试物的饲料或饮水，90天后，各试验组大鼠按雌雄2：1同笼2周，进行交配，然后自然分娩（此间仍饲喂含受试物饲料）。每周称饲料和体重各一次，观察母性行为及是否出现中毒症状。亲代动物处死后可对其生殖系统进行肉眼或病理组织学检查。
分娩后，应尽快检查每窝活仔数，外观畸形和发育情况，每窝选留8只（最好雌、雄各半），期于淘汰。于出生后第5日和第21日称重，第21日断乳（此时亲代可全部处死）。仔鼠断乳后，每组随机取雌雄各10只，雌雄分养，用基础饲料饲喂60～90天，观察指标同亲代。（建议本试验结合亚慢性试验进行）。
5、结果与处理
试验可得出4个繁殖机能指标：
妊娠雌性动物数
受孕率=——————————×100%
交配雌性动物数
正常分娩雌性动物数
妊娠率= ——————————×100%
妊娠雌性动物数
出生第5天活仔数
出生存活率= —————————×100%
出生时活仔数
第21天断乳活仔数
哺育存活率=——————————×100%
出生后第5天活仔数
试验结果可用X2检验进行统计处理。
6、结果评价
根据统计结果的显著（P<0.01）与否以及是否存在剂量反应关系，评价受试物对试验动物繁殖机能的影响。
七、喂养致畸试验
1、动物
选择性成熟的动物，一般用大鼠，每组雌鼠20只以上，雄鼠10以上，注明品系。
2、剂量
采用三个剂量组和一个空白对照组，最高剂量应理想地诱发毒性反应，但在亲代动物中不出现死亡，中剂量应引起最小的毒性反应，而低剂量不应引起任何可观察到的不良反应。
3、给药时期
交配前雄性动物连续给药60天以上，雌性动物连续给药14天以上，雌性动物在受孕后继续给药14天。
4、给药方式
混饲或饮水。
5、检查
同传统致畸试验，给药的雄鼠及末交配上的雄鼠均作剖检，必要时进行病理学组织学检查。
6、结果评价
数据混总列表，用方差分析或X2方检验进行分析及评价。
八、传统致畸试验
1、动物
健康大白鼠，雌鼠日龄为70～85天，无孕、未生育，体重200～300克，雄鼠日龄不小于70天，体重250克以上。注明品系，每组12～20只孕鼠。
2、剂量
高、中、低三种剂量，并另设阴性及阳性对照组。高剂量可使母体产生中毒症状但不使母鼠的死亡率高于10%，低剂量应不引起母鼠有可观察到的中毒症状；在高低剂量组之间按等比级差设立中剂量组，中剂量可引起某些母体中毒以及胚胎毒性症状。
3、给药时期
胚胎器官形成期（7～15天）。
4、给药方式
原则上与推荐临床应用的给药方式相同，内服时应用灌胃法。
5、检查
将雌雄动物同笼交配过夜后，检查交配成功与否，将已受孕的雄鼠取出标明日期，随机分至各剂量组。各剂量组在给药后每隔3天称体重一次，根据体重变化随时调整剂量，并掌握孕鼠的妊娠和胚胎的发育情况，全部动物在分娩前1～2天剖检，观察妊娠的确立，有无死胎和吸收胎及子宫内活胎的发育情况。
（1）活胎鼠的外观检查：区别性别，分别称体重，测身长、尾长，用肉眼进行外部畸形检查。分别检查头部、面部、躯干、四肢、尾部等有无畸形。
（2）胎鼠的内脏检查：将每窝1/2的胎鼠经鲍音氏液固定后，用简单的徒手切片法对胎鼠内脏进行检查。
头部器官通过下列①、②、③、④切面进行观察检查：
①用单面刀片徒手沿口经耳作一水平切面，使上、下腭分开，主要检查有无腭裂，舌缺失或分叉。
②将上述切面切下的颅顶部沿眼球前垂直作额状切面，检查鼻道有无畸形。
③沿眼球正中垂直作第二额状切面，检查眼球有无畸形。
④沿眼球后缘作第三个额状切面，检查脑的畸形。
胸腔、腹腔和骨盆腔器官的检查：沿胸、腹壁中线和肋下缘水平切开胸、腹腔，逐步检查各主要脏器的位置、数目、大小及形状等有无异常。
（3）胎鼠骨骼检查：将剩余的活胎制成的骨骼透明染色标本于放大镜或解剖镜下进行检查。主要观察颅骨、枕骨、颈椎骨、胸内、肋骨、腰椎、四肢骨、尾椎骨等发育及畸形情况。
6、结果评价
将数据汇总成表，用方差分析或X2检验进行分析及评价。
九、小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验
1、动物
性成熟雄性小鼠，每组5只。
2、剂量与分组
试验至少设三个剂量组，同时设阳性及阴性对照组。最大剂量应不使动物出现明显毒性反应，各剂量组之间硬相差10倍。
3、给药方式
一般采用腹腔注射或与临床应用相同的途径。采用5天给药，于第11，12天再连续给药2天，第13天杀鼠。
4、制片
腹腔注射秋水仙素，约6小时后杀鼠，取一侧睾丸，分离曲细精管，低渗、固定、软化、离心、制片、染色、镜检。
5、结果评价
每制小鼠各计数50个精原细胞和初级精母细胞，进行染色体畸变分析，将分析结果用表格列出，计算染色体畸变率。用t检查进行显著性检验，P<0.01并有剂量反应关系为染色体畸形变阳性。