摘 要:本文介绍了传染性法氏囊病病毒(IBDV)的分子生物学研究，鸡传染性法氏囊病的流行特点、临床症状、病理变化、诊断以及防治方面的状况,重点介绍了快速诊断,疫苗防治和药物治疗方面的研究进展。
关键词:鸡传染性法氏囊病;抗原变异;毒力;重组疫苗;诊断;免疫
鸡传染性法氏囊病(Ifectious bursal disease IBD)是由呼肠孤病毒科法氏囊病毒(IBDV)引起的鸡的一种急性接触性传染病。本病多发于3～6周龄幼鸡, 以损害法氏囊中的淋巴细胞为特征;主要症状为腹泻、寒颤、极度虚弱, 增重减少、死亡、机体严重脱水以及法氏囊、肾脏和肌肉的特征性病变,除直接引起鸡死亡与生产性能下降外,还可引起其免疫力下降,增加感染鸡对其他病原体的易感性和对疫苗的免疫应答能力下降。本病于1957年首次在美国特拉华州南部的甘波罗(Gumboro)地区发现,因此又称甘波罗病。该病由Cosgrove于1962年作为一种新的疾病报导,1970年,Hitchner建议将该病命名为传染性法氏囊病。1980年,有人报道IBDV存在第二个血清型,至今未能证明血清2型IBDV分离株有致病性和引起免疫抑制。在我国,1979年邝荣禄等在广州发现本病,1980年周蛟等在北京报道了此病,1982年周蛟等在北京从进口鸡群中分离到IBD-CJ801株,同年程德勤在上海从细胞培养物中分离到一株IBDV,毕英佐从广州分离到两株IBDV,从而证实了本病在我国的存在,并证明是从国外进口鸡中传入的。目前IBD在我国已传遍各地,某些地方发病率高达80%以上,死亡率在30%～70%或以上。1985年,在美国Delmarva家禽生产地区发现了IBDV1型变异株,它能突破标准株的母源抗体的保护。1987年,在比利时北部和荷兰南部均发现IBD超强毒株(vvIBDV),美国、土耳其、南非也报道有超强毒存在,18周龄的鸡也可感染。1989年Chettle等在荷兰分离到高致病力的IBDV毒株,在世界的许多地区,该毒株可以引起IBD的严重爆发并伴有高死亡率。该病现已全球性流行,据调查,美国鸡群的血清阳性率几乎近100%,南美洲约90%,荷兰88%,意大利76%,日本约75%,德国61.5%。本病主要侵害鸡的体液免疫中枢器官法氏囊等淋巴组织,因此该病的危害不仅表现在疫病本身,更重要的是引起鸡体的免疫机能障碍,影响各种疫苗的免疫应答,甚至导致免疫失败。由于免疫抑制,引起继发和并发其它疾病(主要是鸡新城疫、鸡马立克、大肠杆菌病、巴氏杆菌病、沙门氏菌病、球虫病),致使死亡率明显升高,可达80%以上,给养鸡业带来严重灾害,被称为“鸡的艾滋病”。由于IBD可引起免疫抑制,同时,变异株、超强毒株的出现,引起了各国学者的重视,对该病病原分子结构与功能的关系,该病的流行特点、临床症状、病理变化、诊断以及防治等方面进行了广泛研究,现综述如下。
1 分子生物学方面的研究
1.1病毒基因组
IBDV的核酸基因组是由两个片段的双链RNA分子组成,分别称为A片段(大片段)和B片段(小片段),A片段含有3200～3300bp,B片段含有2800～2900bp。A片段含有一个大的开放阅读框架(ORF),由3036个核苷酸组成,编码相对分子量约110kDa由1021个氨基酸组成的前体融合蛋白,其顺序为NH2-VP2-VP4-VP3-COOH;大片段5′-端非编码区(5′-UCR)由360～373个核苷酸组成,起始于966bp,5′-端缺乏甲基化的“帽子”结构,序列保守性很高,可形成稳定的二级结构。大片段起始密码子附近序列具有与真核mRNA起始密码附近相似的Kozak序列,启动子前有一终止密码子,表明ATG是融合蛋白的起始密码。各毒株的大ORF具有相同的起始密码子ATG,但终止密码子可能不同,在大ORF上游非编码区内还有2个潜在的小ORF,即A片段含有3个阅读框架,2个潜在的小阅读框架分别编码1个12氨基酸残基的多肽和1个相对分子量为16.5～17kDa的蛋白,后者称为VP5。大片段的3′-UCR由226～243个核苷酸组成,缺乏polyA尾结构,保守性较高,内部存在一反向互补重复序列,能形成稳定的发夹结构。
1.2病毒的衣壳蛋白
IBDV有4种成熟的结构蛋白:VP1,VP2,VP3和VP4,相对分子量分别为90,37～40,32～35,24～29kDa。VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白,分别占病毒总蛋白的51%和41%,VP1和VP4含量较少,分别占3%和6%;VP2携带中和性抗原位于病毒的表面,VP3具有碱性C-末端区域,位于衣壳的内表面或与内部RNA一起包装。衣壳外层(半径29～33nm)可能是VP2形成的;1995年,Mundt等从IBDV感染细胞中鉴定出一种新的蛋白质,命名为VP5,其相对分子量为21kDa。VP1是由病毒的B基因编码,含有血清型特异性的功能诱导产生中和抗体的抗原决定簇,这些抗原决定簇为构象依赖性的,其诱导的中和抗体能使宿主免受IBDV的感染,因而,它是IBDV的主要保护性抗原表位。VP3由A片段的3’-端编码,存在于A片段前体蛋白加工成成熟病毒蛋白的过程中,可能是一种与前体成熟有关的蛋白酶,其C-末端的碱性区在病毒基因组包装和稳定性方面可能起作用; VP4是一种具有酶活性的蛋白质,在病毒蛋白的成熟过程中起着重要作用,可能是一种蛋白水解酶,能将NH2-VP2-VP3-COOH水解,从而释放出成熟的VP2和VP3。VP5是由A片段编码的非结构蛋白,它是由A片段的第二个开放阅读框架(命名为ORFA-2)编码的,VP5蛋白分子量约为21kDa,比由其推导氨基酸序列估算的分子量16.5kDa要大一些。用荧光抗体能从IBDV感染鸡的法氏囊样品中检出VP5蛋白[5]。在VP5的蛋氨酸起始密码子处通过点突变获得了点突变株,后者在细胞培养中具有复制能力,表明VP5非病毒复制所必需。
1.3病毒抗原变异的分子基础
对IBDV抗原变异的分子基础的研究,集中在病毒的VP2的2个亲水区域。分别是212～224位之间的13个氨基酸残基:D-D-Y-Q-F-S-S-Q-Y-Q-P-G-G;314～324位之间的11个氨基酸残基:T-S-K-S-G-G-Q-A-G-D-Q。Lana等研究了变异株A的VP2基因的变异情况,发现该株VP2开放阅读框架含1509个核苷酸,编码503个核苷酸。变异株A与已发表的其他IB-DV株VP2基因的同源性为98.6%,但在变异株A的VP2中心区(222～334位氨基酸)出现了一个被称为高变区的区域,其284～288位中,苏氨酸取代了异亮氨酸,并导致Chou和Fasmanβ转角的数量减少,从而由亲水区转变为疏水区,表明变异株A抗原性的下降是由VP2氨基酸的微小变化所致,并最终导致免疫鸡发病。Vakharia等研究了经单抗鉴定的4个抗原性不同的IBDV毒株抗原变异的分子基础。他们对美国变异株GLS、DS326、E/Del和疫苗株的A片段进行了克隆和测序,通过其推导氨基酸序列的比较,发现多数氨基酸替换发生于片段A的212至332中心区,尤其是VP2蛋白的212至223和314至324这2个亲水区,比较这些变异株的氨基酸序列和它们与IBDV特异单抗的反应性,确定了病毒中和性表位相关的氨基酸,通过D78与PBG98毒株序列的比较,确定249位的谷氨酰胺为单抗B69识别所必需的氨基酸;而将变异株与其他1型IBDV毒株的序列比较后,发现GLS株321位的谷氨酸为单抗57识别所必需;E/Del株286位的异亮氨酸、318位的天冬氨酸和323位的谷氨酸为单抗67识别所必需;DS326株311位的谷氨酸和320位的谷氨酰胺为单抗179识别所必需。综上,IBDV不同分离株间存在共同抗原,但不同亚型分离株间又存在差异。与经典株相比,变异株、超强毒株VP2蛋白的2个亲水区,即212～224位氨基酸和314～324位氨基酸易发生突变,这种突变又常改变病毒的中和特性,并极有可能导致变异株病毒逃避标准血清1型疫苗的免疫保护作用。
1.4病毒毒力变化的分子基础
八十年代中后期,美国东部地区就出现了一些称为变异株的IBDV(variantvirus),它们不能被针对标准1型IBDV病毒的抗体所中和,后来欧洲、亚洲又分离到一些超强毒株(veryvirulentstrain)。Bumstead等以IBDV超强毒株CS89接种11种亲交系和部分近交系鸡,结果其死亡率相差很大,其中最高的是灰来航品系(BrL),死亡率接近80%,所有存活鸡的法氏囊占体重的比重严重下降。变异株、超强毒株毒力变化的分子基础引起人们的兴趣。Brown等对英国5个超强毒分离株编码主要保护性抗原表位的A片段部分基因(582个碱基)进行了序列及推导氨基酸分析,结果表明,英国4个高毒力的IBDV分离株间彼此高度相关,彼此间不同碱基不超过2个,但与经典的I型毒株间却有很大不同(不同血清亚型至少有29个碱基不同,或有4个氨基酸不同;同一血清亚型的不同毒株间有15个碱基不同,或3个氨基酸不同);英国的超强毒株与较早从荷兰分离的超强毒株相比,不同碱基数不超过5个,不同氨基酸数不超过2个,而与近期日本报道的毒株的序列相比,英国超强毒株只有1个或2个碱基不同,氨基酸则完全相同。Jackwood等尝试了用RT-PCR和内切酶位点来区分变异株与经典株,结果上述方法能将变异株MD、A和1048E与标准株STC、52/70,PBG98、Cu-1、002-73和NC区分开。用相似的方法,他们发现变异株在222、254位氨基酸的点突变是恒定的,而323位氨基酸的点突变是不恒定的。另外,222位氨基酸单一点突变可将不同病毒分开,象STC这样的经典毒株的222位是脯氨酸;Del-E和GLS为苏氨酸,IN、Bursin2和Bio-Buis是丝氨酸,DelA为谷氨酸。Dormitorio等测定了美国东南部IBDV3个变异株和Delmarva地区的2个变异株和3个标准株VP2区域的高变区643个碱基的序列,南部的Art株和Miss株在进化上紧密相关,且与Delmarva地区变异株(GLS和Dele株)不同,与东南部另一变异株Ga也不同,而Ga与Deleware地区E株(DELE)相关程度高(98.32%),除Miss株外,所有变异株222位的氨基酸均发生了脯氨酸向苏氨酸的转变。4个超强毒株与欧洲的超强毒株UK661和日本毒株OKYM高度一致,分子树分析表明:中国超强毒IBDV与欧洲的超强毒株具有相似的来源。与经典1型毒株相比,多数变异株在222、254位氨基酸的点突变是恒定的,而323位氨基酸的点突变是不恒定的。分子流行病学调查结果显示,不同地区分离到的超强毒株间同源性较高,且有较多证据表明,超强毒株来源于欧洲。综上所述,八十年代中后期及九十年代,世界各地均有不同程度的IBDV变异株和超强毒株的流行。超强毒株赖以产生的分子基础尚不明确,与变异株不同,代表性超强毒株UK661的VP1、VP3和VP4比VP2更易发生变异,且不同的超强毒株在VP2的2个亲水区内少数氨基酸还在发生变化,意味着不断会有新的超强毒株出现;另外,VP2的734bp片段中Ssp 位点的出现,常作为超强毒株的表型之一。
2 IBD流行特点
鸡是IBDV的天然宿主,各种品种鸡均能感染,尤以白色轻型品种反应最严重。本病一年四季均可发生,以5～7月为发病高峰。但本病也发生于其它禽类,尤其是火鸡,王世杰等曾报道雏鸭也可发生IBD。病鸡和带毒鸡是本病的传染源,鸡感染IBDV后粪便排毒的时间为两周。粪便、污染的饲料、饮水、工具以及鸡场的工作人员可以机械带毒,成为本病的传播媒介。另外,小粉甲虫蚴也是本病的传播媒介,由鸡舍采集的甲虫蚴磨碎制成悬液喂易感鸡可引起发病。本病主要经水平传播,但病毒也可经种蛋垂直传播。本病往往突然发生,传播迅速,当鸡群发现有感染鸡时,在短时间内所有鸡都可被感染,而邻近鸡舍在2～3周后也被感染发病。通常在感染第3天开始死亡,5～7天达到高峰,以后很快停息,表现为高峰死亡和迅速康复的曲线。死亡率差异大,一般在15%～50%,有vvIBDV存在时,死亡率达70%以上。近年IBD流行出现了一些新的特点:死亡率比过去增加,过去一般在10%以下,现在一般在13%～50%,高者可达80%;发病日龄提前或推后,最初IBD爆发时主要发生于3～6周龄鸡,而目前发病早的有3日龄的幼雏,晚的180日龄成年鸡仍发病;病例不典型而且混合感染或者ＩＢＤ综合症增多; IBD流行多在使用本病弱毒疫苗4～7ｄ后发病;ＩＢＤ的流行不仅抑制或降低了雏鸡对多种疫苗(尤其是新城疫疫苗)的免疫应答,而且提高了鸡对某些微生物的易感性。
3 临床症状
本病潜伏期2～3天,初期症状是部分鸡自啄肛门羽毛,有时引起鸡的啄肛,病鸡厌食,无神,羽毛松乱、无光泽、皮肤干燥、沉郁思眠、排出白色或黄色水样粪便,颈部、躯干部震颤,步态不稳,头下垂,眼睑闭合,脱水,眼窝凹陷,最后衰弱而死亡,病程5～7ｄ。病愈鸡生长发育不良,全身免疫机能降低,易感染其它疾病。急性型IBD,鸡群突然发病,食欲废绝,精神不振,缩颈,1/3的病鸡发烧(41.5～42℃),渴欲旺盛,饮水量剧增。病鸡可在出现症状后1～2ｄ死亡,3～6ｄ为死亡高峰期,6ｄ后死亡逐渐下降,9ｄ后死亡迅速平息或停止。
4 病理变化
病死鸡尸体脱水,胸、腿肌肉出血,腺胃和肌胃交界处有条状出血点,肾脏苍白肿大,肾小管和输尿管扩张,内有尿酸盐潴留。脾脏轻度肿胀,表面有弥散性的灰色点状坏死灶。法氏囊病变具有诊断意义,可见法氏囊内粘液增多,法氏囊水肿和出血,体积和重量可增达正常值的2～3倍,浆膜覆盖淡黄色胶样渗出物,囊本身由正常的白色变为奶油黄色。感染的第5天,法氏囊开始缩小,到第8天仅为正常大小的1/3左右,切开后粘膜皱褶多混浊不清,粘膜表面有点状出血或弥漫性出血,严重者法氏囊内有干酪样渗出物。
5 诊断
根据本病的流行特点和病变特征可作出初步诊断。如突然发病、传播迅速、发病率高,有明显的高峰死亡曲线和迅速康复的特点,胸、腿肌肉出血,腺胃和肌胃交界处有带状出血,以及法氏囊的特征病变就可诊断为IBD。进一步确诊应进行病毒分离鉴定和血清学试
5.1病毒分离鉴定
取发病典型鸡的法氏囊和脾,经磨碎后加入肉汤或灭菌生理盐水作1：5或1：10悬液,离心沉淀取上清液加入青、链霉素各1000Ｕ/ｍＬ,作用6ｈ,取上清液经绒毛尿囊膜接种10～12日龄鸡胚。受感染的鸡胚在3～5ｄ死亡,可见到胚胎水肿、出血。为了鉴定是否为IBDV,可用已知的阳性血清在鸡胚或鸡胚成纤维细胞培养物上作中和试验。
5.2血清学试验
利用血清学试验诊断IBD方法多,特异性强,阳性检出率高,这方面的研究和报道较多。常用的方法有琼脂扩散(AGP)试验、病毒中和(VN)试验、荧光抗体试验、对流免疫电泳试验(CIET)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)技术。近年来,随着人们对IBDV分子变异机制, IBDV复制及其调控机理的深入研究,许多新的、快速有效的诊断和检测IBDV的方法被建立并用于临床。朱红利用抗IBDV的单克隆抗体建立了夹心阻断ELISA,用以检查血清抗体,并与AGP和VN试验进行了比较,结果表明,夹心ELISA的敏感性超过VN试验,更远胜于AGP试验[5]。郭军庆等研制出IBD单抗快速诊断试剂盒,用于临床快速诊断,该试剂盒使用程序简便,能在10～15min内作出准确诊断。罗函禄等建立了SPA协同凝集试验(SPA-COA)超快速诊断IBD获得了满意的效果,该方法灵敏度高,特异性强,不与其它病毒发生交叉反应,能在2min内获得结果。陈士友、王永山用DIG标记探针杂交检测IBDV,马兴树应用火箭免疫电泳技术诊断IBD、黄金海用免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)检测IBDV抗体,樊晓京用反向间接血凝抑制试验检测IBD血清抗体,陈红英用反转录-套式PCR方法检测IBDV,均取得了满意的效果。
6 预防
由于IBDV对环境的抵抗力强,能持久地存在于周围环境中,一旦感染,很难根除,故必须坚持以预防为主。鸡场应制定综合性防制措施,严格卫生消毒,加强饲养管理减少应激因素,并定期检测,做好疫苗接种工作。IBD疫苗有活疫苗和灭活疫苗两大类。常用的活毒疫苗分为强毒株活苗,中等毒力株活苗及弱毒力株活苗。强毒株疫苗如初代的2512毒株,Ｊ-1毒株,对法氏囊损害较大,一般不用或慎用。中毒苗主要有Ｓ-706、LKT、TAD-Y、BJ836、Ｄ-78、Ｓ-706等毒株,可用于一定母源抗体的雏鸡,接种后有轻微反应,以喷雾、饮水免疫雏鸡,有良好的免疫原性。弱毒力株活苗主要有Lukert、LID228、IZ等毒株,对雏鸡经喷雾、饮水、肌肉内、鼻内及眼内接种,对法氏囊不呈现组织损害,但易受母源抗体的干扰,可用于母源抗体水平较低或母源抗体消失的雏鸡免疫。灭活苗对法氏囊病有很好的预防作用。黄建文对不同IBD疫苗免疫效果进行比较,认为IBD灭活苗是预防IBD最有效的疫苗。灭活苗目前主要是用于种鸡在产蛋前进行免疫,以提高下一代母源抗体水平和使下一代母源抗体有较好的整齐度。目前预防幼雏IBD最有效的方法是对种鸡进行免疫接种。幼雏接种弱毒苗后法氏囊会有一定程度的损伤,从而影响其它疫苗的免疫,因此,有人建议在2周龄以内不作法氏囊的疫苗接种。现在已证实,成年鸡接种IBD疫苗后,产生的免疫力可经蛋传递给后代。种鸡在18～20周龄及40周龄时用灭活苗肌注,可使雏鸡获得均匀一致,且水平较高的母源抗体。近年研究较多的基因疫苗,免疫特异性强,免疫应答持久,能对同种病原的不同变异株产生交叉保护,安全稳定,免疫效果确实而倍受人们关注,是疫苗预防IBD的新的课题和新的希望。在国外,Heign成功地用RT-PCR克隆了IBDV的Del Ware野毒株VP2基因,并在大肠杆菌中获得表达。Snyder和Varharia将G’LS-5的Ａ片段基因重组于杆状病毒表达系统,进一步研制出基因工程双价亚单位苗,取得了较好的免疫效果。由于近来发现IBDV超强毒株的存在,以及各种血清型和变异株之间抗原差异性,使得疫苗免疫难以取得理想效果,有时使用疫苗后反而引发其它病。因此,寻找新的药物,比如天然中草药、免疫增强剂、微生态制剂等可能会对IBD的防治有积极意义。
（作者：孙公文 杨为强 李森远）
