摘 要： H9N2亚型禽流感病毒已在世界范围内的禽类中分离确认，并被证实可以传播到人类和低等哺乳类动物。对于它存在的潜在危害已经越来越多地受到关注，相关的研究也相继开展。许多遗传进化的分析为禽或猪流感可以直接感染人提供了证据，通过在人体的适应或与人流感病毒基因重组，可以形成新的病毒株，引起人类流感疫情暴发。文章提示应当密切监控H9N2亚型禽流感病毒，防止人类流感大流行。
关键词：禽流感病毒；H9N2亚型；疫苗
禽流感是由A型流感病毒引起的传染性疾病，该病毒属于正黏病毒科。A型流感病毒不仅能引起禽类严重的疾病，而且对人类和低等哺乳类动物也是如此。按照血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面抗原来区分，禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)可分为不同的亚型。H5N1亚型为高致病性禽流感病毒，引起疫情暴发而已经受到人们的重视，而H9N2亚型为低致病性禽流感病毒，关注程度显然不如前者，但是因为它传播广泛，而且同样可引起人和动物致病，甚至引起疫病的暴发和流行，其危害不容忽视。2003年12月9日，香港发生H9N2亚型禽流感疫情[1]。以前主要是担心H5N1亚型AIV会感染人，现在还要警惕H9N2亚型AIV，从而使禽流感问题变得更加复杂。这是禽流感防治和检验检疫工作的新动向，应当引起足够的重视。下面对H9N2亚型禽流感病毒的进化以及致病特点、检验方法和疫苗的研究现状做一综述。
1 H9N2亚型禽流感病毒的进化以及致病特点
H9N2亚型禽流感病毒从1994年开始被发现时，就已经在中国大陆的家禽中流行[2]。目前，国内外很多学者对H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化及生物学特性进行了大量研究，我国H9N2亚型AIV流行情况较为复杂，存在着多个不同的基因型。Li C J等[2]研究了1996年到2002年间27例从鸡和鸭分离出的H9N2亚型AIV的进化，表明大部分在1996年后分离的病毒抗原性与目前在国内使用的疫苗株不同，其中1998年分离的3例对金钢烷胺耐药。用生物进化理论对此进行分析，表明所有病毒均来源于CK/BJ/1/94-like病毒，并且通过与QA/HK/G1/97-，CK/HK/G9/97-，CK/SH/F/98-和TY/WI/66-like病毒复杂的重组作用形成复合基因型。Li H Y等[3]对2000年到2003年间中国19个省市流感病毒在猪中的血清学和病毒学进行了调查研究，发现在一些地区的猪场H5和H9亚型AIV对养猪业是个潜在的灾难，亦可演变为对公共卫生的威胁。郭元吉等[4]也证实从中国大陆猪上分离的H9N2亚型很可能来源于禽流感H9N2亚型，而且可不通过猪而直接感染人[5]。Choi Y K等[6]分析了2003年香港活禽市场H9N2亚型AIV的进化，H9N2亚型是2001年－2003年活禽间最流行的病毒亚型，至少有6个基因型。 19株H9N2亚型AIV遗传进化分析表明，HA基因都来源于A/Duck/Hongkong/Y280/97或A/Chicken/Beijing/1/94-like系病毒，其非结构基因来自于A/Duck/Hongkong/Y280/97系病毒，而有些病毒的基因和2001年引起香港H5N1亚型禽流感发生的病毒同源性较高。6种基因型发现均能在鸡和鼠中很快复制，感染的鸡没有症状，但携带了两种对鼠的致死性基因。这些研究均提示，控制禽间流行的H9N2亚型禽流感病毒迫在眉睫，以预防此型流感在人间的暴发。
同时，许多学者对H9N2亚型AIV的致病特点进行了很多研究。石火英等[7]通过比较H9N2亚型AIV两种毒株的传播途径，阐明了影响其传播的分子机制。提示NA基因是决定H9N2亚型AIV在鸡间气溶胶传播方式的主要因素。Mikhail N等[8]研究结果显示，从香港活禽市场中分离的H9N2亚型AIV有与人H3N2亚型流感病毒相同的受体，除此之外，禽H9N2亚型在神经氨酸酶的红细胞吸附位点有着与人H2N2亚型和H3N2亚型流感病毒有着典型相似的突变，不同于其他禽流感病毒，这种糖蛋白表面的特征增加了感染人的倾向。另外，H9N2亚型AIV虽然为低致病性禽流感病毒，但是如在禽畜间暴发流行仍然会引起严重的感染，这可能与农场里机会致病菌二次感染有关[9]。
2 H9N2亚型禽流感病毒的检测方法
传统的AIV检测方法主要有病毒的分离培养和血清学诊断。近年来随着血清学试验技术的发展，有几项技术常用于禽流感的监测和诊断。如用血凝抑制(HI)试验检测抗血凝素(HA)的抗体，用琼脂免疫扩散(AGP)试验检测抗核蛋白的抗体，其他还有病毒中和、补体结合、神经氨酸酶活性抑制和单辐射溶血试验等。我国已先后建立了酶联免疫吸附试验、RT-PCR等检测技术。郑其升等[10]研究了将重组H9N2亚型AIV HA蛋白作为ELISA诊断抗原的可行性。试验从重组蛋白的表达，反应原性鉴定，蛋白的提取纯化到作为抗原包被进行ELISA反应，确定了禽流感抗体间接ELISA检测法的最佳工作条件，为检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA 方法的建立奠定了基础。利用重组血凝素做抗原检测流感抗体的ELISA技术，这在国内还是首次报道。张瑞华等[11] 对此也做了相关研究，特异性达到91.57%，敏感性达到92.13%。RT-PCR方法是近几年来发展起来的一种现代分子生物学诊断技术，具有特异、敏感、简便、快捷等优点，而且所需抗原量少，目前已引起国内外学者的广泛关注。利用RT-PCR 方法鉴定AIV的型和亚型是世界动物卫生组织(OIE)推荐的方法之一[12]。马鸣潇等[13]建立了H5和H9亚型禽流感病毒联合RT-PCR一步法检测方法。根据H5和H9亚型HA基因序列，分别设计一套特异性引物，其上、下游引物分别位于裂解位点两侧，可用于H5和H9亚型鉴定、致病力分析以及致病性的变异推测，在国内亦未见相关报道。NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)是在PCR基础上发展起来的一种新的扩增技术[14]，已经用于多种病原体的检测。特别适合于以RNA为模板的扩增，与其他常用AIV检测方法相比，具有灵敏性高、特异性强、操作简便等特点。迄今已成功开发出可检测AIV群特异性H1～H15(NASBA-AIV)，H5亚型(NASBA-H5)，H7亚型(NASBA-H7)的NASBA/ECL检测试剂盒[15]。这些分子生物学方法的建立，为从分子水平上进行早期快速诊断和流行病学调查提供了方法。Chaharaein B等[16]研究了用于快速检测H9N2亚型AIV的RT-PCR-ELISA法，与标准的病毒分离法以及血清学试验(血凝试验和血凝抑制试验)进行比较，基于H9亚型AIV的RT-PCR-ELISA法对SPF鸡体内H9N2亚型AIV检测敏感性与病毒分离法相比达到100%，RT-PCR-ELISA的敏感性是凝胶电泳法的10倍。提示RT-PCR-ELISA法对于检测A型流感病毒，特别是鸡体内H9N2 AIV亚型是一个非常简便、敏感的方法。
3 H9N2疫苗的研究
控制感染性疾病最关键的措施是疫苗的研制。随着H9N2亚型AIV在世界范围内的禽类中被确认，1999年又从人类病毒中被分离出[17]，对于它存在的潜在危害已经越来越多的受到关注。从1998年开始，H9亚型AIV灭活疫苗就在鸡中应用并取得了比较理想的预防效果，有效地控制了疫情的蔓延。各国学者一直致力于寻找安全、耐受性好、抗原性好的疫苗来保护人类。Chen H等[18]利用经典的基因重组途径，产生重组病毒G9/AAca，此病毒包含来源于A/Chicken/Hongkong/G9/97(H9N2)(G9)病毒的血凝素和神经氨酸酶基因和6个来源于AA ca病毒的内含基因片段。在野生型H9N2亚型AIV的攻击下，这种病毒对免疫小鼠产生免疫保护作用。G9/AA ca病毒具有的特点有望被研制成人用疫苗应用于临床。鉴于目前许多养禽场都面临着接种H5和H9两种亚型禽流感灭活疫苗，以及每一种亚型疫苗还不止接种一次的问题，赵雪丽等[19]研制出H5和H9亚型禽流感二价油乳剂灭活苗，经临床应用，二价苗的免疫效力明显高于相同抗原含量的单苗，而且使用方便，减少对鸡的应激，适应我国当前防治禽流感的形势。韦栋平等[20]应用鸡痘病毒作为载体开发的基因工程活载体疫苗，利用同源重组的方法首次将新城疫病毒F48E8株F基因和H9亚型AIV F株HA基因同时插入鸡痘病毒基因组复制非必需区，成功构建了能够同时表达F基因和HA基因的重组鸡痘病毒。这为开发基因工程活载体多联苗来取代ND和H9亚型禽流感常规疫苗的使用，以克服后者干扰免疫监测的缺点奠定了基础。并且，多联苗的免疫策略可以达到一针多免，简化免疫程序，减少应激和节约成本的目的，在禽业生产与疫病控制中具有重要的现实意义。美国Novavax公司报告了其新型类病毒颗粒流感疫苗，获得了令人鼓舞的临床前研究结果。应用该公司的类病毒颗粒技术研制成的H9N2亚型流感病毒(禽流感)疫苗，可以有效保护动物免遭接种活的H9N2亚型流感病毒损害。这一疫苗在无需添加佐剂的情况下，即可在首次皮下注射后产生抗体。该公司的Singhvi指出，由于其类病毒颗粒技术“基于一种短生产期的可升级方法”，因而更适用于“在流感大流行时，短期内制备大量疫苗。Stephenson I等[21]研制的人类禽流感H9N2亚型病毒疫苗已进行了临床试验，结果显示，疫苗安全性以及耐受性良好，全病毒疫苗效果要好于重组亚单位疫苗，受试的60名中24名抗体滴度升高(年龄全部大于32岁)，但32岁以下受试者效果微弱。
4 结语
尽管目前尚无有力证据说明AIV可以在人类之间互相传播，但这种病毒的变异性强，经过重组，产生可以感染人的新的流感病毒，进而引起人类流感大流行。H9N2亚型属于低致病性禽流感病毒，未引起人们的重视。研究证实，H9N2亚型可以直接感染人[16]。通过它的流行状况调查及分子生物学研究，提示H9N2亚型有可能与其他流感病毒重组成新型病毒，对人类的健康存在潜在的巨大威胁。研究快速检测方法以及制备高效的禽流感疫苗是预防和控制H9N2亚型禽流感流行的重要措施。因此，应当引起重视，采取措施，控制H9N2亚型AIV的流行，防止疫情暴发。
( 张正姬 苏州市疾病预防控制中心检验科，江苏苏州 215004)
参考文献（略）