摘 要：鸡球虫病是严重危害养禽业的一种寄生虫病。一直以来，鸡球虫病主要依靠药物来进行防治。但是，随着球虫抗药性问题的日益严重，抗球虫新药开发困难及人们对食品安全的关注，药物在球虫病控制中的作用越来越受到限制，因而用免疫方法来控制鸡球虫病日益受到重视，并有望成为主要的技术手段。目前鸡球虫免疫学研究主要集中在鸡球虫免疫原性、宿主免疫应答及寻找有效的鸡球虫保护性抗原等方面。近年来随着分子生物学和现代生物技术的发展，鸡球虫基因工程疫苗以其独特的优势显示其在未来球虫病控制中的诱人前景，并可能取代传统疫苗而成为鸡球虫病防治的主要手段。
关键词：球虫；免疫原性；体液免疫；细胞免疫；鸡
鸡球虫病是严重危害养禽业的一种寄生虫病，该病分布很广，世界各地普遍发生，15日龄~50日龄的雏鸡发病率高，死亡率可高达80%。鸡球虫病的病原体为艾美耳属(Eimeria)球虫，全世界道的有9种，但为世界公认的有7种。我国报道至少有7种，即柔嫩艾美耳球虫（E. tenella），毒害艾美耳球虫（E.necatrix），堆型艾美耳球虫(E.acervulina)，巨型艾美耳球虫(E.maxima)，和缓艾美耳球虫(E.mitis)，早熟艾美耳球虫(E.praecox)和布氏艾美耳球虫(E.brunetti)[1]。鸡球虫病在全世界每年给养禽业造成超过20亿英镑的直接经济损失[2]。自1950年起，人们开始使用抗球虫复合药物来控制鸡球虫病[3]，但是，近年来由于耐药虫株的不断出现、新药研制又十分困难，加之药物残留对环境和食品所造成的污染等，迫使人们不断寻求新途径来控制球虫病，包括免疫、生物技术、遗传等方法[4]。文章主要从鸡球虫免疫原性、宿主免疫应答及球虫保护性抗原等方面对鸡球虫病的免疫学做一概述。
1 球虫免疫原性
球虫的生活史比较复杂，各发育阶段的免疫原性不同。子孢子是球虫直接入侵宿主免疫系统的第1个发育阶段，Garg R等利用弗氏完全佐剂乳化子孢子抗原后免疫2日龄雏鸡后，通过粪便积分，ELISA、淋巴细胞转移抑制实验，发现子孢子抗原能较好地刺激机体产生一定的免疫应答[5]。McDonald等用柔嫩艾美耳球虫Wis强毒株诱导出的缺乏第2代裂殖生殖的弱毒株Wis-F-96免疫鸡后，发现免疫鸡能够抵抗Wis株卵囊的攻击。但不能抵抗Wis株第一代裂殖子的攻击。组织学研究结果表明，保护性免疫主要是抑制第1代裂殖体的发育，而第2代裂殖子盲肠接种后100%能继续发育，这说明第1代裂殖子有很强的免疫原性。Kendall和McCulough提出柔嫩艾美耳球虫的第2代裂殖体能诱使鸡只产生免疫力。谢明权等将具有活力的第2代裂殖子接入鸡体的盲肠，经过一段时间，再用球虫卵囊攻击时，其死亡率、增重和病变记分均优于对照组。说明产生了一定的保护性免疫反应。因为上述裂殖子进入鸡体后，大部分进入有性繁殖阶段，故该试验也首次证明球虫的配子发育阶段也具有一定的免疫原性[6-7]。
综上所述，球虫每一阶段都具有免疫原性，但是却很难鉴定在诱发保护性免疫中起关键作用的虫体阶段。也许保护性抗原是由各个阶段虫体抗原共同组成的。
2 宿主免疫应答
2.1 体液免疫
体液免疫，主要表现在宿主体内抗体水平的变化。研究表明，一般接种卵囊后1周内便可检测出循环抗体。其中IgM出现最早，很快达到峰值后，迅速下降，并且发现无记忆应答。IgG出现和达到峰值时期都较晚，下降亦慢。Song K D等用pMPl3DNA疫苗分两周2次免疫1日龄雏鸡，而后用E.acervulina攻击，在攻击后10 d，检出循环抗体，而且血清抗体呈现剂量依赖性反应，即高剂量疫苗诱导高剂量抗体[8]。还有学者认为母源抗体与抗球虫有一定联系。Smith等发现种蛋鸡感染E.maxima后，卵黄中含有抗E.maxima的IgG抗体。Talebi等也证实巨型艾美耳球虫感染鸡后，特异性抗体能够由母体传递到鸡蛋，且子代体内母源抗体提供的持续性保护力可使子代在相当一段时间内免受球虫病的威胁。我国学者郑明学等研究结果也显示雏鸡体内母源抗体水平与雏鸡抗球虫水平的变化具有高度一致性[9]。
由此可见，体液免疫在球虫保护性免疫机制中起到的重要作用不容置疑。但是由于球虫是细胞内寄生的原虫，所以体液免疫并不起主导作用。其具体机制还有待于进一步研究。
2.2 细胞免疫
细胞免疫在抗球虫病中起着重要作用。研究结果表明细胞免疫在球虫免疫应答中处于核心地位。细胞免疫应答主要通过各种各样的细胞群体起作用，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞等[10]。而T细胞免疫反应起着主导作用。
根据T细胞表面抗原，可将其分为CD4+T细胞（辅助性T细胞）和CD8+T细胞（细胞毒型T细胞）。CD8+T细胞在抗球虫病中起到了十分重要的作用。在球虫病中，选择性地用抗CD8+的单克隆抗体清除CD8+细胞后，用E.tenella和E.acervulina感染后鸡的病情加重。Lillehoj H S也证实了CD8+T细胞在抗E.tenella、E.acervulina感染中的作用。最近研究表明，CD8+T细胞主要在再感染中起重要作用。Lillehoj H S通过清除鸡CD8+T细胞试验表明，这些鸡对E.tenella、E.acervulina再次感染的抵抗力下降[11]。其原因主要是由于细胞毒性T细胞在第1次球虫免疫后的分化增殖过程中有一部分细胞停留在分化中间阶段而不再往前分化，成为记忆细胞，在再次遇到相同球虫抗原时不需辅助性T细胞的刺激就可直接活化，并大量增殖，迅速反应，发挥免疫效应杀灭感染球虫的靶细胞，所以是抵抗再次感染的主力[12-13]。
CD4+细胞也在抗球虫感染中起重要作用。Bessay发现用E.acervulina感染鸡后，十二指肠IEL（上皮间淋巴细胞）中CD4+数目从感染后4 d~8 d有很大的提高。Verbelde发现白来航鸡初次感染E.tenella后盲肠中CD4+数目在感染E.tenella两天后有明显提高。Yun C H等[14]用E.tenella感染对球虫抵抗力强的SC鸡和对球虫易感性强的TK鸡研究发现，初次感染后，SC鸡盲肠扁桃体中CD4+数量多于TK鸡中，但是在再次感染后，TK鸡中的CD4+多于SC鸡中。并推测CD4+/ CD8+比率与他们的抗球虫能力有关。总之，种种结果显示，CD4+T淋巴细胞在初次免疫中发挥着重要作用，主要起免疫诱导、调节作用。
2.3 细胞因子
近年来，关于细胞因子研究的报道比较多，并发现细胞因子在抗球虫感染中有着重要的作用。细胞因子有多种，国内外研究比较多的是γ-干扰素（INF-γ）、白细胞介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子（TNF）。
在球虫保护性免疫中INF-γ起着重要的作用。INF-γ由Th1,CD8+及NK细胞产生。Lillehoj H S等[15]将INF-γ与保护性抗原基因融合方式插入真核表达载体，构建成核酸疫苗免疫鸡后发现，核酸疫苗免疫鸡对鸡球虫感染有一定的保护性作用。Min W等[16]研究了8种细胞因子对堆型艾美耳球虫DNA疫苗(pcDNA3-1E)免疫的辅助效果，也发现同时皮下注射10 μg INF-γ，同单独注射50 μg pcDNA3-1E免疫相比，体内球虫繁殖速度明显减慢。IL-2在宿主免疫系统中有重要的功能。IL-2是一种有效的生长因子，对多种细胞起作用，例如能促进T细胞的分化、B细胞的发育、NK细胞的活性。Choi K D等[17]在用E.acervulina感染鸡的实验中表明，脾脏和肠中IL-2 mRNA转录水平在初次和再次感染后都有明显增强。Miyamoto T等[18]用E.tenella子孢子刺激脾脏淋巴细胞培养物上清中IL-2水平，在初次感染后比对照组功能明显升高，且IL-2可引起机体对再感染的细胞回忆应答。TNF也是一种重要的细胞因子，主要由一些活化的单核细胞、巨噬细胞、NK细胞等一些淋巴细胞产生，很多传染性或炎性刺激物也能够刺激TNF的生物合成。Zhang S等[19]证实细菌内毒素脂多糖或E.tenella子孢子、裂殖子可刺激鸡HDLL巨噬细胞和外周血液中巨噬细胞产生TNF,适量TNF有利于机体清除虫体。
从以上可以看出，细胞因子的作用不可忽视。而且人们已经将目光投向利用细胞因子来治疗球虫病以及在构建重组疫苗或基因工程苗时加入某种细胞因子来提高疫苗保护效果。这也为防治球虫病开辟了新途径。
3 鸡球虫保护性抗原
随着分子生物学和免疫学的发展，球虫疫苗的研制已经进入到分子水平。为了制备有效的基因工程疫苗，寻找球虫的保护性抗原就显得十分重要。近年来，人们的目光多集中在与子孢子入侵相关的细胞器抗原上。而以抗原对T细胞的刺激能力为标准来筛选保护性抗原这一思路也为寻找球虫保护性抗原提供了新的途径和方法。
3.1 细胞器抗原
微线是顶复合器中的重要器官，位于子孢子和裂殖子前端，能分泌10多种蛋白质参与球虫与肠道细胞的黏附作用及球虫的侵入过程。研究表明，微线蛋白共约有20种，目前已有多种基因被克隆，如EtMIC-1、EtMIC-2、EtMIC-3、 EtMIC-4、EtMIC-5等[20-21]。现已鉴定出的两类微线蛋白(EtMIC-l，EtMIC-2)都与虫体入侵宿主细胞有关，其中, EtMIC-2是球虫微线上的一类50 ku左右的酸性蛋白质,已有研究表明EtMIC-2基因的表达产物能诱导鸡体对E. tenella产生一定的免疫保护作用[22]。
折光体出现在子孢子阶段，子孢子侵入宿主细胞后，两个折光体合二为一，并在随后的裂殖生殖过程中逐渐消失，据此折光体蛋白被认为和虫体入侵有关[23]。SO7(也被命名为GX3262)是第一种被发现的折光体蛋白,其重组蛋白表现出良好的免疫原性。Crane等用重组SO7蛋白免疫1日龄雏鸡,随后用E.tenella,E.maxima,E.acervulina以及E.necatrix 4种球虫做攻虫试验,结果发现与对照组相比,免疫组的病变记分减少了50%。Pogonka T等[24]用SO7沙门氏菌重组菌口腔免疫3周龄白来航鸡,两周后测到了抗SO7的特异性抗体,抗体水平维持了6周。折光体上的另一种抗原Etp28（SO7’）也备受瞩目。实验表明柔嫩艾美耳球虫子孢子折光体抗原Etp28的单克隆抗体在体外能抑制裂殖子的发育，其cDNA克隆表达的融合抗原(CheY-SO7\')纯化后肌肉注射鸡体能激发部分保护效应,甚至能抑制另外3种球虫（E.acervulina，E.maxima，E.necatrix）的感染[25]。
3.2 表面抗原
发现较早的具有免疫潜能的表面抗原有540l和cSZ-l。540l抗原是E.tenella的一个3l ku的表面片段，其结构特征是具有一个高度重复的氨基酸序列，9个氨基酸重复了5次。用540l抗原与弗氏完全佐剂一同经皮下免疫4周龄雏鸡，结果2周后出现抗体应答，4周后免疫鸡对攻毒产生部分保护。CSZ-l抗原是堆型艾美耳球虫的一个大约为10 ku～15 ku的片段，体外试验证实能刺激免疫鸡的T细胞反应，但未发现有任何形式的保护性免疫作用[6]。3-1E是E.acervulina子孢子与裂殖生殖阶段的表面抗原,全序列长1 086 bp,含有一个阅读框架,由170个氨基酸组成;抗3-1E重组蛋白的单克隆抗体可以与E.acervulina、E.tenella、E.maxima的子孢子和裂殖子反应,重组3-1E蛋白可以促进E.acervulina免疫鸡的脾细胞发生增殖反应以及诱导γ-干扰素的生成;用杆状病毒或大肠杆菌表达的3-1E蛋白免疫雏鸡后,免疫组卵囊排出量均明显减少[15]。
3.3 T细胞刺激的抗原
众多实验表明，球虫病的保护性免疫机制中，抗体的作用很小，真正对再感染产生免疫保护作用的是T细胞介导的细胞免疫，而以往所用抗血清筛选而来的抗原在激发细胞免疫能力上存在的不足，也证明了这一点。因此，近年来人们逐渐使用细胞免疫相关指标来判定和衡量抗原的免疫原性。Breed等以抗原对T细胞的刺激能力为标准筛选出具有较强免疫保护作用的蛋白组分，取得了良好的效果。在国内李祥瑞等首次以抗原对脾脏和盲肠扁桃体T细胞的刺激能力和动物保护性试验为指标观察了E.tenella孢子化卵囊的可溶性抗原及其组分的免疫保护作用，结果表明，筛选出的3.2蛋白含有2条多肽，分子质量分别为37 ku和40 ku,可以有效保护感染鸡抵抗E.tenella的攻击。这些无疑为筛选良好的保护性抗原提供了新的方法和途径[26]。
4 结语
总的来说，经过国内外学者的不断努力，人们在鸡球虫的免疫原性、宿主免疫应答、球虫保护性抗原等方面都取得了一定的进展。比如国内外学者对宿主免疫应答的研究结果表明细胞免疫应答在球虫感染过程中占主导地位；关于细胞因子的研究，为人们研究球虫疫苗提供了新的思路；已经筛选了很多球虫保护性抗原，为研制鸡球虫基因工程苗提供了候选抗原分子。但是还有许多问题没有弄清楚，像球虫寄生的宿主特异性和寄生部位特异性机理，宿主细胞允许球虫进驻的最主要的原因，宿主自然感染和免疫后的保护性免疫机制有何不同等方面还有待于继续研究[5]。今后的主要研究方向应集中在球虫共同保护性抗原的筛选及构建新型疫苗等方面。相信随着分子生物学技术的发展，不久的将来在球虫病的免疫预防方面会取得突破性进展。