摘要：轮状病毒病是引起人和动物肠胃炎的一种传染病，发病率和死亡率较高，至今没有特效药可以治疗，传统疫苗预防效果不佳。随着生物技术的不断发展，一种新型的转基因植物疫苗有望解决这个难题。人类和动物食用了这种转基因植物之后，就可以获得抗体，产生免疫力，以预防此病。
关键词：轮状病毒；肠胃炎；转基因植物；疫苗
轮状病毒（Rotavirus）是引起人和动物肠胃炎的一种病原微生物，其临床症状表现为发热，呕吐，恶心，腹泻，严重时可导致婴幼儿以及幼畜脱水，致使新陈代谢失去平衡。在发展中国家，每年由轮状病毒引起5岁以下儿童肠胃炎和脱水死亡的达到60万~80万人。相比之下在美国仅有40人~100人。幼畜发病日龄小，发病急，死亡率高。葡萄糖口服液可用于补充腹泻期间体液损耗，能暂时解救生命，但不能消除病毒的危害，现有的抗病毒药不能预防或控制轮状病毒感染，也没有可行的化学疗法。传统的疫苗预防效果收效甚微，所以急需研制一种有效预防该病的疫苗。
1 轮状病毒的特征
轮状病毒属于呼肠病毒科轮状病毒属[1]。无囊膜，二十面体，带有3层结构的衣壳蛋白。外层包括VP4和VP7，内层是VP6，核心层是VP1、VP2和VP3。电子显微镜观察显示出一个60 nm~80 nm带有辐射状突起的车轮。VP4形成突起。根据血清学分类为血清组，这些血清组共享交叉抗原反应。依据轮状病毒抗原性和它们的RNA片段电泳的迁移率，这些血清组可分成为6个组，即A，B，C，D，E组和F组。人类和动物病毒株多数属于A组，B组和C组在人和动物身上发现有。D组，E组和F组仅在动物上有。在外壳蛋白VP4和VP7抗体的中和反应的基础上，将一个血清组内病毒再细分成血清型。每个组内的病毒基因能够进行重组或交换DNA片段，但是不能发生在两个不同血清组之间。病毒基因组包含11个双链RNA基因片段，多数片段包含一个长的ORF（除基因11片段外）。
2 转基因植物疫苗的优点
随着生物技术的发展，已经研究出多种疫苗来预防病毒病。其中转基因植物疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗。1992年Mason首先提出了转基因植物疫苗的定义[2]，即利用分子生物学技术把外源基因导入到植物细胞中，在植物中能够大量表达外源基因的一种生物技术。与其他疫苗相比，转基因植物疫苗具有以下优点：①原核表达系统不能对表达产物进行准确的翻译后加工和蛋白糖基化和磷酸化，植物与动物细胞表达系统一样，可对表达蛋白进行糖基化、酰氨化、磷酸化、亚基的正确装配等翻译后加工，使表达产物具有良好的免疫原性和生物活性；②细菌在产生蛋白时常形成一些包涵体，不易溶解，需要高成本来重新溶解蛋白并折叠成天然蛋白；③转基因植物仅需要阳光和水分以及来自土壤中营养物质；④与动物细胞相比，植物细胞培养条件简单，而且具有全能性，能再生植株，基因整合后便可长期使用。还有不会对动物和人类造成危害；重组转基因植物疫苗可长期储存于植物器官（种子，块茎，果实），在低温甚至室温下长期保存，其抗原结合活性下降少；利用转基因植物生产口服疫苗，不用纯化，降低生产成本，使用方便。这样，为转基因植物疫苗在医学科学和植物生物学方面的发展提供了一个有效策略。
3 转基因植物表达系统
3.1 瞬时表达
瞬时表达［2-3］是重组植物病毒携带外源疫苗基因，通过系统感染，使植物表达抗原。在合适的条件下，通常在数小时后就能检测到转化的外源基因的表达产物，其在1 d~2 d内达到高峰，随后又逐渐降低，至10多天后完全消失。瞬时表达是未整合的外源基因表达，质粒DNA导入植物细胞后，大部分未插入到植物染色体上，而是以游离状态存在，这部分质粒DNA在瞬时表达中起重要作用。整合进染色体部分的DNA在瞬时表达中不起作用或表达量极为微弱。尽管如此，一些学者认为能否进行瞬时表达可作为随后能否进行稳定转化的一个早期指标。其常用的方法有基因枪法、重组农杆菌抽真空转化法和修饰的病毒载体感染法，最常用的是抽真空转化法。
3.2 稳定表达
它是一个比较稳定的转化基因生产路线，外源基因整合到核基因组DNA分子上，并能够稳定地遗传外源基因的表达。它通过植物器官的无性繁殖或者种子有性繁殖来增殖，这个方法适用于公共的可食性疫苗临床试验。它能使重组DNA插入到植物基因组或植物细胞的叶绿体内。核转化最经常用方法是农杆菌转化法，它能有效地输送DNA到植物细胞和靶核酸结合在染色体DNA的任意位点。农杆菌株已被去掉病毒基因，病毒基因能引起植物产生肿瘤，但是仍保留那些介导DNA有效转移T-DNA，它位于特殊的边界序列之间。农杆菌T-DNA的结构特点与真核基因结构基本相同，在基因起始密码上游30 bp处有TATA盒，在80 bp处还有CAAT盒。每个T-DNA基因的3′末端还有一个或多个多聚腺苷酸的信号肽序列AATAA。T-DNA基因没有内含子，其进入植物细胞后能够借助植物细胞的系统进行复制、整合和表达，是与核DNA基因完全相同的稳定表达。一些重要的植物种类不适应农杆菌的转化。对于这些植物，最常用的是轰击方法（基因枪方法）。用基因枪把微金属粒子包裹的DNA注射到植物细胞里，结合到染色体DNA上。轰击法转基因的综合拷贝数比农杆菌高，能增强表达。然而，核基因的过多拷贝或高水平表达能引起基因沉默，导致低水平的表达。
轰击法也用于介导外源基因转到叶绿体基因组内。尽管这种转基因植物已被应用一少部分种类生产，在禾谷类植物中叶绿体转化潜能是比较强的。叶绿体基因组高拷贝数在植物细胞中有助于增强重组蛋白的表达，例如，一个融合基因已被插入到烟草染色体基因组，每个细胞有10 000多拷贝而且导致重组蛋白的堆积，其占总溶解蛋白的47%。叶绿体基因工程可以提高环境质量。最重要的是叶绿体能加工成真核状态的蛋白，而且在其内表达产物能正确折叠并形成二硫键，同时，还由于整合具有精确的位置，因此消除了外源基因表达经常遇到的位置效应，使表达更加稳定而有效。在叶绿体表达系统中也未见转基因沉默发生。
4 转基因轮状病毒植物疫苗的研究
VP6蛋白[1]是轮状病毒第6个基因编码的内壳蛋白，含量比较丰富，约占病毒蛋白的50%。它在血清组反应中起主要的决定性作用，也是普通诊断试验的靶蛋白，所含的抗原可作为进一步将轮状病毒分成为亚组的依据。近来研究表明，在成鼠轮状病毒感染模型中，VP6已被定义为保护抗原。VP6具有较高的免疫原性和反应原性，没有中和抗体反应。Matsumura T等[4]报道了转基因马铃薯中牛A组轮状病毒（GAR）免疫原VP6蛋白的生产。转基因马铃薯在花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子或修饰的启动子的控制下，连接到烟草花叶病毒5′端的非编码区，用ELISA方法可检测到GAR抗原。通过Western blotting检测表达蛋白的大小，其结果与GAR的VP6蛋白是一致的。PCR和RT-PCR方法检测了VP6基因的存在和其转录产物。ELISA检测其含量占总溶解蛋白的0.006%～0.02%。将转基因土豆浓缩抽提物加上乳化剂通过腹腔注射接种成年Balb/c鼠，免疫后，收集的血清用ELISA和Western blotting方法检测有抗VP6应答。这些结果说明，植物中VP6蛋白免疫原的表达有利于诊断试剂的制备。
Yu J等[5]发表了转基因马铃薯中轮状病毒衣壳蛋白VP6的表达以及它在鼠中的口服免疫性。鼠源轮状病毒VP6基因的1.2 kb的cDNA片段克隆到植物表达载体pPCV701上,通过农杆菌介导法转入马铃薯茄科植物GV3101pMP90RK内。用免疫斑点杂交检测植物合成的VP6衣壳蛋白分子量与纯化病毒VP6蛋白以及部分装配的病毒样粒子的分子量相同。用ELISA检测转基因马铃薯叶子和茎块中合成VP6蛋白含量，其约占总溶解蛋白含量的0.01%。给CD1鼠口服免疫转基因土豆茎块组织，检测到抗VP6血清IgG和肠内的IgA抗体的滴度。黏膜免疫接种后，体液和肠道内的抗体与轮状病毒衣壳蛋白抗原反应结果为可食性植物疫苗预防和治疗肠道病毒病原体的可行性提供了良好的依据。
Chung I S等[6]报道了悬浮培养的转基因番茄细胞中含有重组轮状病毒VP6蛋白产物。将牛轮状病毒IND VP6插入到植物表达载体pILTAP357构成重组质粒pILTAP357-VP6(13.94 kb)，通过三亲杂交转化到番茄中，Western blotting检测已转化到番茄中。在转基因番茄细胞内，表达的牛轮状病毒VP6初次在细胞内检测到，分子质量为44 ku。在一个摇瓶内，温育18 d后转基因番茄细胞可产生0.33 mg重组VP6蛋白。通过NASA方法转基因细胞在模拟微重力的条件下可产出0.15 mg的重组VP6蛋白。
VP7[1]是由第7、8或9基因编码（根据不同的病毒株系）的外壳蛋白，也是病毒表面糖蛋白（G蛋白），其含量占病毒蛋白量的30%。功能VP7蛋白使病毒附着和进入易感细胞，其决定病毒血清型以及介导中和反应。在诱导异源性中和抗体方面发挥重要作用，它能有效地刺激肠道局部初次免疫反应。李晋涛等[7]报道，将人源轮状病毒抗原基因VP7与pB 121植物表达载体连接，通过电转化将重组质粒转入农杆菌，其侵染马铃薯外植体，用PCR和Western blotting检测结果表明已整合到马铃薯中并已表达。费蕾等[8]将鼠源A组轮状病毒VP7转入到马铃薯中，通过PCR检测，VP7基因已成功地整合到马铃薯中，为制备新型口服疫苗奠定了基础。
Wu Y Z等[9]发表了转基因马铃薯中表达轮状病毒VP7蛋白口服免疫鼠，其诱导出高滴度的黏膜中和IgA抗体。将人源轮状病毒（HRV）结构蛋白VP7基因与植物表达载体pB 121连接，构成重组质粒pB 121-VP7，通过农杆菌侵染转化入马铃薯中。检测结果表明，当轮状病毒VP7转入到马铃薯基因组内后，其能维持它的中和免疫性。用转基因茎块免疫鼠后，已成功地检测出血清IgG和黏膜IgA抗体。其黏膜IgA滴度达到1 000，IgG滴度只有600。中和试验表明IgA能中和轮状病毒。这些结果显示，在转基因植物疫苗的生产和传输方面，植物作为生物反应器的巨大潜力。
NSP4[1]是一个非结构蛋白，也是一个保持完整ER（内质网）膜蛋白，它构成双壳粒子而且使它们的芽容易进入ER的内腔。NSP4动员钙离子，调节蛋白运输到高尔基体，而且很可能在轮状病毒的小泡运输到最外表面和病毒粒子周围膜短暂的丢失扮演一个重要角色。有人认为NSP4是一个病毒肠毒素。Kim TG等[10]发表了转基因马铃薯中霍乱毒素B亚基与轮状病毒NSP4融合蛋白低聚体的合成。鼠源轮状病毒非结构蛋白（NSP4）基因与肠毒素（CTB）基因连接构成融合基因CTB-NSP4，其编码175个氨基酸，CTB-NSP4与植物表达载体pPCV701连接，通过农杆菌介导转化到马铃薯中表达。用PCR扩增方法检测出转基因叶子基因组中的CTB-NSP4基因。免疫斑点杂交分析了转基因茎块抽提物中全长CTB-NSP4融合蛋白的合成和组装成5聚物的寡聚结构。镶嵌在肠上皮细胞膜受体的CTB-NSP4融合蛋白五聚物用G-M1-ELISA方法检测在转基因马铃薯中的含量。ELISA结果说明其蛋白含量占总溶解块茎蛋白的0.006%～0.026%。在转基因马铃薯块茎中CTBNSP4单体和它们的组装成有生物活性多聚体说明，以食用植物可利用性来合成轮状病毒肠毒素抗原，保留它们所有的致病的抗原决定簇，以便启动最大黏膜免疫反应。
5 展望
研究人员已试用多种方法来防治轮状病毒感染，其中之一是转基因疫苗（植物疫苗）。因为它可以有效地预防轮状病毒感染以及应用方便，将成为防治轮状病毒感染的越来越重要的方法。植物的多种优越性可被用于转基因疫苗研究，这些技术已达到了一个新的发展阶段。然而，仍有一些障碍必须克服[2，11]，如蛋白在植物中的表达水平低，表达产物在植物中的稳定性，转基因口服疫苗在产生免疫反应之前在胃肠道内有时被消化等，科学家就这些问题正在进行研究并加以解决。例如，选用合适的启动子、增强子、植物表达载体以及对密码子进行优化等提高表达水平；在完整抗体分子和Fab片段的N末端附加一段内质网信号序列使其进入分泌途径，可以提高蛋白积累水平；而在scFv的N末端加一段信号序列，C末端附加4肽KDEL滞留信号使其定位于内质网上，可得到较高的蛋白量。在外源基因上加一些修饰基因或者将表达蛋白进行包裹来保护蛋白在口服时不被消化，从而达到免疫的作用等。将来，人类可直接食用水果和蔬菜获得抗体，动物吃草来产生抗体，这样不用打针、吃药就可以达到预防疾病的目的。
（张二芹1，2，李世访2，王春凤1，钱爱东1
1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118；2中国农业科学院植物保护研究所，北京 100094）