摘 要：传染性支气管炎给我国规模化养鸡业造成巨大的经济损失，由此尝试研制重组鸡痘病毒传染性支气管炎病毒基因工程疫苗了解其免疫效应，以期获得高效而安全的基因工程疫苗。为更好地了解鸡传染性支气管炎的防治现状，文章从各种表达载体系统表达传染性支气管炎病毒蛋白的优缺点及其产生免疫保护效应的角度，对近年来传染性支气管炎病毒疫苗研究的发展状况做了简要概述，且针对传染性支气管炎病毒基因工程疫苗现存的问题，展望了将来的发展趋势。
关键词：传染性支气管炎;传染性支气管炎病毒;疫苗
传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）是由冠状病毒科的传染性支气管炎病毒（Ｉnfectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，以呼吸道症状、产蛋率下降、肾脏病变等为特征。自1988年以来，在我国大部分地区相继流行，发病率100%，死亡率10%～30%。国内每年由此病造成的经济损失超过10亿元。在规模化饲养条件下，传染性支气管炎感染率更高，病型更加复杂，防治难度更大，危害更加剧烈。因此，研制高效、安全的疫苗预防和根除传染性支气管炎，减少因此而带来的巨大经济损失，成为广大科研工作者迫切需要解决的问题。为更好地了解鸡传染性支气管炎的防治现状，本文对近年来传染性支气管炎病毒疫苗研究的发展状况做了简要概述。
1 弱毒疫苗
在使用的弱毒苗中以荷兰株H52和H120应用最广泛，且有较好的免疫保护性，其次是Conn株强毒致弱的疫苗株。活疫苗能有效刺激机体的免疫系统，激发体液免疫和细胞免疫，同时使用方便，生产成本低。Wakenell P S等将商业化的IBV马萨诸塞州41株疫苗在鸡肾组织培养物中传代到40代，继而用HVT与IBV在实验室条件下形成二价胚疫苗进行联合免疫，结果这两个弱毒疫苗的免疫效果互不影响，从而能有效地预防雏鸡感染传染性支气管炎。但鉴于IBV可在感染机体存在持续的潜伏感染，弱毒疫苗有可能成为其突变的主体和重组变异的供体，且其易引起严重的上呼吸道支气管反应，特别是对于1日龄鸡。同时肾型与支气管炎型的免疫机制还存在着很大的差别，这在很大程度上亦影响着疫苗的免疫保护作用[1]，这使得致弱活毒疫苗在理论和实践上都不可能从根本上彻底控制IB的流行。
2 灭活疫苗
Gough等1977年就报道了用油乳剂灭活苗使IB得到有效控制，但是，由于IB血清型的多样性，单价灭活苗并没能阻止IBV变异株引起IB的暴发。随后，Finney（1990）等研究表明IB二价苗能刺激良好的抗体反应；王红宁等（1999）对我国IB的流行病学调查表明，Mass型占19.7%、T型占21.1%、Gray型占9.3%、Hotle型占3.9%，变异株占43.4%，提出了用不同血清型毒株多价灭活疫苗预防本病更为有效的科学依据，在国内率先研制出了多种多价油乳剂灭活苗。区域试验证明，该疫苗对鸡安全无副作用，并能有效地预防IB。灭活疫苗的不足之处是使用剂量大，需要配合佐剂，制备过程比较复杂，因而成本较高，即使全病毒灭活苗也需2次以上的加强免疫方能有效引发中和抗体的形成[2]。
3 基因工程疫苗
基因工程疫苗是指在高效表达系统中表达出来的强毒病原体的某种免疫相关抗原。常用的表达系统为大肠杆菌、酵母和昆虫细胞表达系统，这些表达系统能够对病毒的免疫相关抗原进行高效表达，但仍存在完全不能或部分糖基化﹑磷酸化的问题，从而不能真实的表达免疫相关抗原蛋白。如黄亚东（2003），廖明（1997）分别在毕赤酵母和昆虫细胞中表达了IBV的 S1基因，所表达蛋白的分子量小于天然蛋白[3-4]。尽管这些表达系统存在一定的缺陷，且IBV S1基因中和位点的高度构象依赖性一定程度上妨碍了S1亚单位蛋白疫苗启动免疫的有效性，但有资料表明单独使用传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗免疫仍可产生一定的保护免疫效应。Song C S等重组杆状病毒表达了IBV嗜肾KM91毒株S1基因，单独用重组的S1糖蛋白免疫对肾的保护率为50%，而用异源弱毒疫苗株H120初免再用重组杆状病毒S1糖蛋白进行加强免疫，对肾的保护率达到83%，这些实验数据表明单独使用重组杆状病毒S1糖蛋白免疫可产生一定的免疫保护效应[5]。
4 核酸疫苗
DNA免疫能快速有效的启动对非连续、构型依赖性复杂抗原位点的免疫反应，甚至仅仅表达决定CTL、TH或中和位点的8个～9个寡聚氨基酸的疫苗，也能诱发有效的CTL和中和抗体应答，细胞免疫在IB的免疫保护反应中起着关键作用。DNA疫苗免疫在构建多价疫苗方面具有突出的优势，只要克隆新毒株的基因就有可能构建相应的疫苗，同时简单的将不同血清型的表达质粒混合或将基因，甚至编码血清型特异中和位点或位点的寡聚核苷酸序列克隆于同一质粒，就有可能形成新型的多价疫苗。但另一方面免疫接种途径和方式，免疫剂量，免疫佐剂，高免疫原性抗原的选择，高效表达载体的构建等因素对DNA疫苗的免疫效果有很大影响，而目前的基因免疫技术不是太成熟，导致基因免疫效果并不理想。
刘思国等（2001），陈洪岩等（1999）分别将鸡传染性支气管炎病毒S1基因和N基因构建成真核表达质粒接种SPF鸡，结果显示40%的鸡可耐过IBV强毒的攻击，血清IgG抗体在攻毒前后呈现规律性变化，说明S1基因在鸡体内得到了表达，并使鸡获得了一定免疫力，但保护作用不及传染性支气管炎病毒油苗，分析认为，肌注质粒吸收不佳，致使主要免疫原蛋白表达量不高而使免疫保护率不高[6-7]。为了达到更好的免疫效果，设计一个完美的免疫策略是很重要的，Darrell R等[8](2003)将阿肯色州IBV血清型的S1糖蛋白基因DNA疫苗通过胚内接种或肌注，结果显示，18日龄的鸡胚用含S1糖蛋白基因的DNA疫苗免疫，3周后用弱毒苗加强免疫使鸡得到完全保护，而单独用DNA疫苗不足以预防IBV。免疫后未显示以前所报道的抗体反应，但仍然有不同水平的保护效应，可能是因为含有特异CTL表位的DNA疫苗免疫鸡刺激产生了交叉反应脾T细胞，脾T细胞裂解不同血清型病毒感染鸡的靶细胞，故而对鸡产生了不同水平的保护效应。但免疫病理组化研究结果显示，胚内接种或肌注DNA疫苗免疫不能提供对IBV的局部免疫。为了诱导局部免疫反应，可能有必要把疫苗靶向定位到支气管组织，这需要通过DNA疫苗与佐剂混合靶向到黏膜表面。另据Ramani等报道，含有报告基因的仙台病毒衣壳产生了假病毒样颗粒能靶向到真核细胞中的Balb/c鼠肝细胞，靶向传递佐剂能使DNA疫苗精确传递到疾病感染的组织中，可能诱导局部保护性免疫反应。此外，BOOTS发现了IBV N蛋白内有CD4表位。Jagoda等进一步证实IBV NP蛋白具有诱导交叉反应抗体和细胞介导免疫反应的作用。Yu Ｌ等把诱导CTL免疫反应活性的部位定位到了N蛋白的C末端120个残基多肽处。因此，NP蛋白也可作为DNA疫苗免疫的目的基因，进行IBV不同免疫原基因的联合免疫可能会好于单独使用S1基因免疫的效果[9]。
5 活病毒载体疫苗
活病毒载体疫苗是用基因工程方法将一种病原免疫相关基因整合进另一种载体基因组DNA的复制非必需片段中构成的重组活载体疫苗。在被接种的动物体内，特定免疫原基因可随重组载体的复制而适量表达。常作为载体的病毒有痘苗病毒、禽痘病毒、疱疹病毒、腺病毒和反转录病毒等。
5．1 禽痘病毒载体
随着对禽痘病毒分子生物学研究的逐步深入，利用禽痘病毒载体表达外源基因已经成为当前新型疫苗研究最活跃的领域之一。利用禽痘病毒作载体其特征为，病毒不能整合进入基因组； 可携带多个基因，宿主细胞谱广； 瞬间表达转基因。 但缺点是难以大量产生。在美国，新城疫和禽流感就分别有两个重组鸡痘病毒产品得到了美国农业部的批准，现在表达H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗也获准在紧急情况下使用[10]，由此可见鸡痘病毒（Fowl poxvirus，FPV）已经成为研究开发并逐渐转向实际应用的一个最为成功的病毒载体，尤其在动物传染病的控制上具有广阔的应用前景，既可用于禽类重组病毒疫苗的研究，又可作为哺乳动物的非复制型载体。
TFM等用重组鸡痘病毒表达IBV S蛋白，免疫小鼠产生了中和抗体。TOC分析证明这个重组病毒免疫鸡能抵制IBV的感染[11]。Wang X等（2002）用重组鸡痘病毒表达了马萨诸塞州41株的S1基因，免疫鸡受到部分保护，并且试验结果显示，翅下免疫接种效果更好[12]。另一方面，鸡患急性传染性支气管炎时，诱导产生旺盛的细胞毒细胞活性，这种细胞反应与感染疾病的最初下降有关。进一步研究表明，感染鸡产生的CTL反应主要是针对N蛋白C末端的119个氨基酸残基的[13]。在急性感染时，IBV诱导产生旺盛的特异性CD8+ CTL活性以抗N蛋白的C端该区域，抑制IBV复制。这种细胞反应是消除病毒感染细胞的主要防御机制，并与病毒荷载的降低和临床疾病的消除密切相关。且IBV N蛋白的氨基酸序列在各种不同的IBV毒株中也是高度保守的[14]。基于上述依据，Yu等（2003）用重组鸡痘病毒表达IBV的C末端NL蛋白120个氨基酸进行预防研究，实验结果显示，痘病毒表达的衣壳蛋白的C末端119个氨基酸是宿主保护抗原且诱导了一些IBV株交叉保护免疫[15]。
从以上这些研究表明，采用禽痘病毒作为载体表达IBV主要免疫原基因产生的免疫效应，可以很好的抵制和预防IBV强毒的攻击。
5．2 腺病毒载体
黏膜免疫预防IBV感染中支气管，泪腺，输卵管局部产生抗体的重要性已被证明。因此，用复制缺陷性载体表达IBV免疫保护性抗原诱导黏膜免疫的疫苗代替弱毒苗是较为理想的。重组腺病毒作为基因载体已在基因转移，载体疫苗和基因治疗等各个方面得到广泛应用，这主要是由于复制缺陷性腺病毒有着独特的优点：①腺病毒可感染的宿主细胞谱广，包括了一些非分裂细胞和末端分化细胞；②腺病毒可容纳的外源片段较大，可达7.5 kb；③E1基因的缺失，重组腺病毒是缺陷性的，这意味着在感染细胞内不会产生感染性病毒粒子；④重组腺病毒可同时经交叉递呈抗原和细胞的活化作用诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，且其免疫期持续时间长；⑤腺病毒载体能有效的转导非分裂细胞，且载体不会整合进入染色体DNA，另一个优势是可获得高病毒滴度(大于1011)；⑥腺病毒载体的缺陷是腺病毒基因表达产物引起免疫反应最终可能中和了感染的细胞，最终使得连续免疫产生的临床免疫效果不理想。现在复制缺陷性腺病毒已被应用于表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），口蹄疫病毒和牛疱疹病毒I型的保护性抗原基因。但腺病毒可在淋巴组织产生持续性感染，为了提高重组活载体病毒疫苗的安全性，研制出了宿主特异性禽腺病毒活载体苗。用禽腺病毒主要晚期启动子调控下的血清8型禽腺病毒表达Vic S株IBV S1基因，对0或6日龄雏鸡口腔免疫且在35日龄攻毒，试验结果显示,接种后的第6天，对于IBV同源和异源毒株在支气管的保护率达到90%～100%，细胞介导免疫对于同源和异源IBV毒株的保护是至关重要的。其产生交叉免疫保护反应的机制可能是通过特异表达IBV S1基因的重组腺病毒侵染黏膜组织，在盲肠扁桃体中初步复制，可能会诱导产生一种CTL反应导致交叉血清型保护，也可能是在支气管中诱导了抗S1的特异性IgA抗体。对于规模化养禽业来说，一次性免疫，廉价而有效的疫苗很重要，而且用腺病毒作载体表达IBV的保护性抗原作为活病毒载体疫苗代替弱毒苗，可减少新变异株的出现[16]。
5．3 传染性支气管炎病毒载体
随着分子生物学技术的不断发展，对IBV的基因组结构及其复制，转录调控机制有了更深入的了解，构建IBV感染性分子克隆并用它作为活病毒RNA载体表达异源基因，报告基因及γ-干扰素，表明所构建的IBV RNA载体是可行的[17-19]。很快IBV将作为活病毒RNA载体表达外源基因，为更有效的预防传染性支气管炎做出贡献。
6 转基因植物疫苗
转基因植物疫苗是Mason于1992年提出的，该技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物，并使植物能大量表达重组蛋白的一类生物技术。王红宁等（2003）通过RT-PCR获得IBV S1基因片段，并将其导入玉米表达载体进行了表达[2]。此外，Zhou J Y等（2003）用土壤杆菌属系统构建含有IBV S1基因的载体转化马铃薯，在马铃薯中表达了IBV S1糖蛋白并免疫鼠和鸡，通过3次免疫后，免疫鸡受到完全保护，此结果表明转基因马铃薯表达的IBV S1糖蛋白也可作为防治IBV的疫苗资源[20]。
7 展望
尽管各国科学家们用不同的表达系统表达了IBV的主要免疫原基因，也产生了一定的免疫保护效应，但目前的大多数IBV基因工程疫苗与传统IBV疫苗免疫效应相比，还是有些逊色。如何进一步提高IBV基因工程疫苗免疫效果的问题已经成为科研人员着力研究的热点。采用恰当的表达系统使得表达的传染性支气管炎病毒的主要免疫原性蛋白完全糖基化或磷酸化，达到天然免疫原性蛋白的抗原性，是目前研制IBV基因工程疫苗需要攻克的难点之一。此外，尽管目前对于IBV的免疫大多数研究都集中于S1蛋白，但IBV S1蛋白的抗原变异影响了传统IB弱毒疫苗免疫效果的稳定性，相比较而言，IBV毒株中N蛋白的保守性和诱导产生较强的体液免疫和细胞免疫水平的良好特性给我们一种提示，围绕S1蛋白抗原变异的问题及调查IBV毒株中交叉保护的可能性，用活病毒载体共表达S1蛋白和N蛋白的主要保护免疫抗原部分，以观察其产生的免疫保护效应，是将来应该研究的一部分。总之，随着分子生物学的不断发展，人们逐渐对病毒的基因组结构及其主要免疫原基因的功能有了深入的了解，开发IBV基因工程疫苗，从主要免疫原性蛋白的良好表达到免疫策略的不断完善，以克服传统疫苗的不足之处，已成为未来防治IB的趋势。
（田占成1，王云峰2，童光志2，刘光远11.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001）
参考文献：(略)