摘 要:口蹄疫是引起偶蹄动物的急性发热性水泡性疾病,具有高度接触传染性,对发病国家和地区经济有破坏性作用和不良的政治影响。口蹄疫病原体为小RNA病毒科的口蹄疫病毒,是一类单股正链RNA病毒,该病毒有多种血清型及其亚型,相互之间无交叉保护力或保护力极其有限。目前,口蹄疫病毒感染的分子机理还不是很清楚。口蹄疫病毒感染细胞的过程主要包括病毒与细胞的吸附、病毒穿透细胞壁进入细胞、病毒粒子的脱衣壳、病毒RNA的翻译转录、病毒基因组的复制以及病毒粒子的成熟过程,最后是成熟的病毒粒子衣壳包装成为完整病毒。文章就口蹄疫病毒感染细胞的过程做一概述。
关键词:口蹄疫病毒;感染过程;细胞
口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)是引起偶蹄动物口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)的病原体,该病毒属于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。FMDV有7个血清型,型内又有许多亚型,型间及亚型间无交叉保护力或保护力很有限,所以防制难度极大。
FMDV在细胞上有一个相对短暂的感染过程,新的感染性病毒粒子通常在感染后4 h~6 h生成。FMDV是杀细胞感染,所以受染细胞会表现出形态的变化,通常称致细胞病变(CPE),包括细胞变圆和细胞膜通透性改变及其重新分布。同时,该病毒还能引起细胞生化功能的改变,如抑制宿主细胞蛋白翻译和转录等。本文就口蹄病毒的感染过程做一简要综述。
1 病毒与细胞的吸附、渗透及其脱衣壳
研究者对FMDV与细胞的相互作用进行了大量的研究,普遍认为FMDV受体在疾病的发生和发展上可能具有重要的作用[1]。在4 ℃或37 ℃培养条件下,通过有限的受体位点,FMDV可快速地结合到细胞上。据测定每个细胞的受体位点在103~104个之间。研究表明,FMDV的7个血清型中有6个能结合到同一类受体位点上,其中个别血清型的FMDV结合到第二类受体上[2]。研究证实一定量的胰蛋白酶消化会使病毒粒子失去感染性而不能结合到细胞上。对这些病毒粒子的分析发现在VP1的第144位精氨酸(Arg)发生单次裂解,第144位Arg位于VP1表面的G-H环内,起连接βG和βH(G-H环)的作用[3]。试验表明VP1的这个区域可能与细胞受体相互作用。
1984年,Pierschbacher M D和Ruoslahti E对纤联蛋白与细胞的结合性研究发现,三肽序列Arg-Gly-Asp(RGD)是病毒的识别位点,同时在FMDV VP1蛋白上也发现该序列。随后他们证实纤联蛋白受体是膜转移糖蛋白大家族中的一类,以非共价形式结合于细胞表面,参与细胞吸附、细胞迁移、血栓形成以及淋巴细胞相互作用等。研究发现FMDV的G-H环内围绕RGD的序列都是可变的,但RGD序列本身却是高度保守的。这就提示RGD序列可能参与病毒与受体的相互作用[4]。因为已证实含有RGD的小分子肽能抑制病毒与细胞的结合。即通过敲除或突变感染性cDNA克隆中的RGD序列,使病毒粒子失去感染性而不能吸附到易感细胞上,不能引起易感动物发病[5]。FMDV的VP1蛋白具有延展性,其中编码VP1蛋白的基因中就有RGD序列。已证实在细胞培养中,RGD序列参与细胞的结合。实验证实CAV9利用整联蛋白αVβ3作为其受体。竞争结合试验证实CAV9和抗体对整联蛋白αVβ3的作用能抑制FMDV与猴肾细胞结合。同时,Duque H等[6]用含有人或牛αVβ3整联受体基因的cDNA感染细胞,发现不表达整联蛋白受体的细胞以及对FMDV不易感的这些细胞对病毒感染逐渐许可。后来又证明FMDV也能利用其他的两个αV整联蛋白受体αVβ6和αVβ1,但是,FMDV不能利用整联蛋白αVβ3作为其受体。到目前为止,在所有利用RGD识别序列的FMDV整联蛋白中,还没有对任何一个整联蛋白受体的特性进行分析。
在体外FMDV可利用大量的可替换受体介导感染。如病毒抗体复合物通过Fc受体吸附感染细胞。此外,人工构建了一条由抗FMDV单克隆抗体单链和细胞内黏附分子I融合重组的一个受体,这个受体也利用敲除RGD序列的病毒感染细胞。1996年,Jackson J等[7]报道一株O1型FMDV能利用黏多糖肝素(HS)作为一类共用受体。这个发现与Baxt B等的发现相吻合。但是, Baxt B发现A型FMDV不能结合到CHO细胞上,因为这类细胞只有HS受体,缺乏FMDV的整联蛋白受体。后来他们选择了一株O1型FMDV变异毒株,该变异株VP3的第56位氨基酸残基上有一个带正电的Arg,而且能在CHO细胞上增殖,对牛致病力较弱。相反,另一个在VP3的第56位含有His的变异株不能在CHO细胞上生长,对牛致病力强。对HS-O型FMDV复合体的结构分析表明HS与VP3蛋白的56位氨基酸残基发生直接的相互作用。
目前,FMDV的渗透作用和脱衣壳机理还不是很清楚。但证实病毒吸附到细胞表面之后,140 S病毒粒子分裂为五聚体组成的12 S,然后释放出RNA。近来,有人运用基因工程原理构建了一株FMDV,该病毒不能完成VP0到VP2和VP4的突变裂解,这株构建的FMDV没有感染性,对酸性敏感,能吸附到培养细胞上[8]。因此说,140 S病毒粒子到5聚体亚单位的分解不会导致病毒产生感染性,但分解后一定有其他现象出现。这些结果表明,病毒受体仅仅负责病毒入驻到易感细胞膜上,在病毒脱衣壳方面不发挥作用。这也与FMDV能利用多种受体感染培养细胞的原理相一致。
2 病毒的翻译
病毒脱衣壳后,释放RNA,开始RNA翻译。在RNA翻译前,首先是细胞酶对连接蛋白VPg的裂解。与细胞mRNA不同,病毒mRNA在其5′端没有7-甲基-G的帽子结构,而蛋白质的合成要在核糖体上通过不依赖帽子结构的机制进行。当L-pro-裂解蛋白合成起始因子eIF4G时,在感染细胞内依赖帽子结构的mRNA的翻译受到抑制。eIF4G作为桥梁连接mRNA帽子结构与40 S核蛋白体亚单位。这种作用主要是通过帽子结合蛋白的结合来完成,即eIF4E连接eIF4G的N端区域,而C端区域则是eIF3连接eIF4A和40 S核蛋白体亚单位。但是FMDV RNA翻译的启动仅需要L-pro-裂解生成eIF4G裂解产物的C端,该裂解产物可结合到FMDV的IRES上,且与连接eIF4A和eIF3的40 S核糖体亚单位相互作用。此外,现已确认在48 S起始前体复合物和80 S核蛋白体内,eIF4B也能结合到FMDV IRES上[9]。
FMDV IRES可与大量的细胞蛋白相互作用,包括对正常细胞mRNA翻译起重要作用的翻译起始因子,后来被认为是多聚嘧啶区结合蛋白(PTBP),经证实它至少与IRES的两个区域相互作用。若减除IRES的这两个区域,这种细胞因子既抑制蛋白的结合,又抑制了体外翻译[10]。最近,又确认了第二类细胞因子,它是FMDV IRES驱使翻译的必需因子。这种细胞因子是IRES特异性翻译作用因子(ITAF-45),同PTBP相似,也是48 S翻译起始复合体所必需的。第三类宿主因子PCBP,是脊髓灰质炎病毒RNA翻译所必需的。有人推测PCBP使脊髓灰质炎病毒基因组循环更易于调控病毒翻译和RNA复制之间的平衡。
RNA翻译启动后,首先合成一条多肽链,多肽链经裂解形成结构和非结构蛋白。首先,L-pro-自我催化从多聚蛋白链上裂解下来。然后2A(一种18氨基酸多肽)也自我催化从P2蛋白上脱离,但仍与P1前体保持关联。研究表明这种裂解不是一种蛋白水解的过程,而是2A短肽对翻译机制的调控过程,2A短肽使P1-2A从核糖体上释放,允许下游蛋白继续合成。但是,这种推测没有得到证实。因此,在病毒体系中,可采用2A短肽来裂解多肽链上的外源蛋白。除了突变裂解外,所有的其他多聚蛋白的裂解都由3C-pro-完成[11]。Grubman和他的同事已经勾画出3C-pro-对FMDV的Cys163,His146和Asp84的作用位点。蛋白激酶能裂解许多不同的双肽序列包括Gln-Gly、Glu-Gly、Gln-Leu和Glu-Ser[12]。
3 病毒的转录和基因复制
小RNA病毒的复制有许多未解之谜。例如,病毒RNA依赖性RNA聚合酶(3Dpol)必须区分病毒RNA和细胞mRNA,因为二者在3′端都连接poly(A)尾巴。此外,很可能有一种机制来区分包装成病毒粒子的RNA和结合在核糖体上的细胞RNA。目前,相对肠道病毒转录和复制的研究来讲,对FMDV转录和复制的研究还很少。
小RNA病毒复制的第一步是合成负链RNA分子。但FMDV还没有这方面的研究,据推测可能与脊髓灰质炎病毒RNA的复制模式相似。研究证实,在脊髓灰质炎病毒感染的细胞中,聚合酶前体(3CD)积聚于细胞中,然后结合到5′端的三叶草结构上,调节PCBP对IRES的亲和力,这种调节作用是翻译所必需的[13]。在FMDV RNA复制中, 3CD是否有类似的作用还不清楚。不过,已证实在FMDV感染细胞中,3CD蛋白可被快速裂解为3C pro 和3D pro。
关于小RNA病毒负链RNA合成的起始仍有争议。有一个模型提出由于poly(A)结合蛋白(PABP)与poly(A)尾巴的3′端和PCBP-3CD-5′三叶草结构的相互作用使病毒基因组的循环容易后,病毒才开始启动翻译转录。在FMDV基因组中,5′端的作用可能发生在S片段内,也可能有poly(C)片段参与其中。因为启动负链合成就发生于存在细胞mRNA的细胞浆中,且细胞mRNA也包含poly(A)尾巴,所以很可能有一种聚合酶识别病毒RNA的机制。在小RNA病毒感染细胞中,病毒基因负链和正链RNAs都连接VPg,同时还有小分子蛋白连接的二核苷酸VPgUpUp,该现象表明VPg可能是RNA聚合酶的一个引物。后来cre的发现为解释VPg的尿苷酸化和聚合酶区分病毒RNA和细胞RNA提供了依据。Cre是首先发现于FMDV基因组5′UTR内的RNA环状结构,其上有一个AAACA的保守基序,它对脊髓灰质炎病毒和鼻病毒负链RNA的合成是必需的[14-15]。在细胞培养中, FMDV cre的这个保守基序的突变可大大降低病毒的复制效率。目前,还不清楚在起始阶段是否利用游离 VPg或需要一类裂解前体(3AB、3ABC或3BCD)。第二个模型是负链RNA的合成要预先在poly(A)尾巴上进行。
翻译启动后,开始3D-pro催化的负链RNA的延伸。为此,起始复合体必须移位到正链模板的3′端。但推测PABP与poly(A)结合的位置正是正链上接近cre的区域。新链延伸形成一种复制中间体(RF)后,新的正链合成就开始了。在脊髓灰质炎病毒感染的细胞中,正链与负链的比值大约是50∶1。这表明一条负链可能是合成多条正链的模板,因而会形成复制中间产物——双链RNA分子。目前,从RF开始合成正链的机理还不清楚。
要合成正链,RF必须是松散未卷绕的。小RNA病毒的2C蛋白有ATPase活性。研究证实FMDV 2C蛋白和细胞蛋白(p38)都可结合到负链3′主环上,发挥松动RF分子的作用。已证实细胞解旋酶或核蛋白可能参与这些过程,因为转染到完整细胞中时,RF具有感染性,但转染到去核细胞时却失去感染性。目前3D pol对正链的延伸机制尚不明了。
RNA合成发生于膜复制复合体内,该复合体来自于内质网和高基尔体膜且含有P2(2B,2BC和2C)和P3(3A和它的前体,3C pro和3D pol)区域编码的非结构蛋白。在FMDV感染细胞中,已检测到含有RNA和3D pol的与肠道病毒复制复合体结构相似的复合物[15]。经证实2B蛋白能增加膜的通透性,阻断蛋白分泌,但是它在RNA合成中的作用还不清楚。同时还发现在FMDV感染细胞的膜周围聚集着蛋白2C,这种现象可直接提示FMDV RNA的合成。小RNA病毒的感染导致宿主细胞转录被快速抑制,这种抑制好像与宿主细胞蛋白翻译的抑制没有关系。经证实在FMDV感染细胞中3C pro裂解组蛋白H3,同时这种裂解不出现在脊髓灰质炎病毒或EMCV感染的细胞中。就肠道病毒感染来讲,通过RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ催化的一系列转录被抑制,而这种抑制作用还必需有3C pro的合成。3C pro是用来裂解激活这3种酶的细胞转录必需的细胞因子。因此,FMDV可能利用不同于肠道病毒的机制抑制宿主细胞的转录。
4 病毒粒子的衣壳包装和成熟过程
病毒复制周期的最后一步是正链RNA的衣壳包装和VP0裂解为VP2和VP4,以便形成成熟的病毒粒子。从大的范围讲,P1区3C-pro的裂解产物被组装成含有VP0,VP1和VP3各一拷贝数的启动子结构,5个启动子就组装成一个5聚体,然后12个5聚体再装配成病毒衣壳结构。随着病毒RNA衣壳包装,然后是裂解后病毒粒子的成熟(VP0到VP2和VP4)。在小RNA病毒感染细胞中发现大量的中间病毒粒子,包括启动子,5聚体,含有未裂解VP0的RNA粒子,以及包含有无RNA的未裂解VP0的粒子(空衣壳)。在小RNA病毒成熟过程中有两个问题至今仍不清楚,即RNA的衣壳包装需要何种信号以及空衣壳和前病毒粒子发挥何种作用。
小RNA病毒仅对正链RNA衣壳包装,且只有新合成的正链RNA才进行衣壳包装,这表明RNA复制和衣壳包装之间相互关联。在正链RNA衣壳包装中cre可能发出衣壳包装的信号。据推测衣壳包装的信号可能不仅局限于基因组P1区域,因为脊髓灰质炎病毒感染细胞中已有缺损干扰颗粒(DIP)的报道,在这些DIP内都存在P1区域缺失。但在FMDV感染细胞中没有检测到缺损干扰颗粒(DIP)。此外,许多小RNA病毒包括FMDV,完整的P1区域都能被敲除或被一个能产生复制子的报告基因所取代。利用脊髓灰质炎病毒复制系统证实[16],在转录翻译过程中,如果提供异源小RNA病毒的结构蛋白时,不会发生复制子RNA的衣壳包装,即衣壳包装对任何小RNA病毒都是特异性的,几乎都在P1区域外的基因内。目前有一个未被证实的关于FMDV基因组用异源性牛肠道病毒结构蛋白包装病毒粒子的报道[17]。近年来,在新发现的小RNA病毒 Aichi病毒基因组5′端主环始端的4个碱基被认为是cis发挥衣壳包装的因素[18]。这是小RNA病毒科中关于这个作用因子的首次报道。
在FMDV感染细胞中,还没有前病毒粒子的报道,但在其他的小RNA病毒复制过程中已有出现前病毒粒子的报道。现有两个小RNA病毒组装模型。第一个模型提出5聚体组装成空衣壳,随后RNA插入其中。第二个模型认为五聚体直接与RNA作用形成前病毒粒子。在任何一种情况下,普遍认为VP0的N端十四烷基化对于衣壳蛋白的形成是必需的。对FMDV的研究已经说明具有放射活性标记的物质能从结构蛋白追踪到启动子、5聚体、空衣壳和最终的病毒粒子上[19]。但是,最近又证实在无细胞复制系统内,只有脊髓灰质炎病毒5聚体能与新合成的病毒RNA相互作用形成病毒粒子,这表明空衣壳是5聚体的存储粒子或是组装反应的副产品。
组装后的病毒粒子最后将VP0裂解为VP2和VP4,这个过程需要病毒RNA。在FMDV空衣壳内有VP0异常裂解的论述,该现象表明病毒RNA对于正确裂解的发生是必需的[20]。普遍认为裂解是自我催化的过程,主要由VP2保守的组氨酸残基产生,它可激活局部的水分子,引起一类亲核子对易断裂键和裂解的攻击。突变性裂解是生成感染性病毒粒子所必需的。在FMDV VP0内针对点突变形成无感染性前病毒粒子,并表现出类似于感染性病毒粒子的受体结合性和酸敏感性。但是,对于酸性变化,生成的5聚体比成熟病毒的五聚体更具有疏水性,这进一步表明VP0的裂解是病毒RNA释放到细胞浆中的必需环节。
随着分子生物学技术的不断发展,FMDV的感染机理的研究取得了一定的成果,但鉴于世界范围内口蹄疫的破坏性和严重性,防制和根除口蹄疫的工作仍很艰巨。因此,有必要深入研究口蹄疫病毒感染的详细过程,为进一步彻底根除口蹄疫提供理论依据。(沈小燕1,2,常惠芸1,丛国正1,刘永生1,王建华2,谢庆阁1 1.中国农业科学院兰州兽医研究所,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州 730046;2.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌 712100)