摘 要：猪圆环病毒是近年来新发现的畜禽病毒之一,疑为一种潜在人兽共患病病原，具有重要的经济意义。文章就其检测技术，如病毒分离、电镜观察、聚合酶链式反应（PCR）、多重PCR、多重套式PCR、定量竞争性PCR、PCR限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）、免疫组织化学技术(IHC)、原位杂交技术(ISH)等的研究进展做一阐述。
关键词：Ⅱ型猪圆环病毒；检测技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是1974年德国学者Tischer首次从猪肾传代细胞系PK-15细胞中发现的一种污染病毒，由于该病毒不产生细胞病变，所以一直未被重视，因而在猪群中广泛传播。国际病毒学会分类委员会第六次病毒分类报告中，将包括鸡贫血病毒、猪圆环病毒、鹦鹉喙羽病病毒在内的3种病毒设立了圆环病毒科。该科病毒是所有已知动物病毒中最小的，病毒粒子直径14 nm~25 nm。PCV有PCV-1和PCV-2两个型，二者血清抗体之间有部分交叉反应，基因组结构有显著差别。ORF-1、ORF-2为2个主要的开放阅读框，ORF-1-在两株PCV间相对保守，而ORF2可变性大。
新发现的几种疾病，如猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾炎综合征、繁殖障碍、仔猪的先天性震颤、增生性坏死性肺炎都与PCV-2有关。近年PMWS在我国猪群中呈流行趋势，造成了很大的经济损失。由于猪群中普遍存在PCV抗体，血清学诊断结果并不可靠，所以该病的诊断工作一般都在病猪死亡后进行。同时，PMWS病的症状和病变没有特征性，基本与PRRS相似，因此仅凭症状、病变及流行病学调查很难做出准确判断。为此，各国兽医工作者进行了大量的研究，建立了多种高度特异性的病毒学、免疫学和分子生物学诊断方法，如病毒分离、电镜技术、PCR技术、ISH、IHC、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验等，检测PCV、病毒抗原或核酸。 本文就目前国内外PCV的检测技术研究进展进行综述。
1 病毒分离
猪圆环病毒的分离培养多数是使用通过PCR确认没有PCV污染的PK-15的克隆PS细胞。我国的吕艳丽等从北京、河北分离了3株PCV-2，并对其中的2株进行了测序，序列分析比较发现，它们与欧美分离毒株具有很高的同源性[1]。研究表明，从正常PK-15细胞中分离的圆环病毒无致病性，被命名为PCV-1；而加拿大学者Ellis等(1998)在 PMWS中分离到了猪圆环病毒，有致病性，被命名为PCV-2。1997年Clark首次报告了在加拿大有PMWS。1999年PMWS被证实是由一种“新”的Ⅱ型猪圆环病毒引起。
2 电镜观察
在电镜下可以看到猪圆环病毒特有的直径约为17 nm的球型结构。
3 PCR检测
PCR是一种快速、简便、特异的诊断方法。Larochelle R等、Hamel A L等根据PCV-2的基因序列设计出特异的PCR引物，进行PCR检测，建立了特异的PCR方法[2-3]。PCR以其敏感、特异、快速、准确的优点成为目前病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术，在PCV的检测方面应用广泛，且发展了很多改良的技术。
3.1 多重PCR检测
Calsamiglia M等建立了一种多重PCR法，可对PCV进行检测和定型[4]。作者根据PCV-1和加拿大PMWS猪中分离的PCV-2的ORF-1和ORF-2序列设计2套引物。这2套引物都可以对PCV进行检测和定型。但这种方法的一个重要缺点是当PCV-1和PCV-2共同感染时不能检测PCV-2，造成误诊。Larochelle R（1999）首先建立了多重PCR方法成功检测PCV，并可对PCV-2定型。研究发现，PCV-2是猪群中的主要流行株。最近，Huang等[5]建立了一种简单的多重PCR法，可对PCV进行检测和定型。该方法设计了2套引物，是根据PCV核酸链上的ORF-1和ORF-2设计的。
3.2 多重套式PCR检测
Janghyun Kim等建立的多重套式PCR可对PCV-1和PCV-2进行检测并定型[6]。通过设计两套引物，一套引物扩增PCV-1的349 bp片段中的317 bp，另一套引物扩增PCV-2的481 bp片段的225 bp片段。多重套式PCR的敏感性与普通多重PCR 相比提高了1.6倍，同时第二次扩增又可以鉴定第一次扩增的特异性。
3.3 定量竞争性PCR检测
Liu Qiong等建立了竞争性PCR方法检测血清中的PCV的DNA[7]。选取PCV-1和PCV-2的ORF-2中变异性高的区段设计两对型特异性引物，并引入一个外源片段的重组质粒，以此作为竞争性模板，用上述两对引物扩增出的PCV-1或PCV-2片段能够与野毒株的扩增片段相区别。当倍比稀释的已知浓度的质粒DNA和待测DNA共同的PCR产物的电泳条带亮度相同时，便可以推算出待测DNA的浓度。
4 PCR-RFLP检测
PCR-RFLP是指在生物进化过程中，DNA碱基序列发生插入、缺失或突变，从而改变了限制性核酸内切酶的识别位点。因此，同种生物不同个体的DNA分子用同一种酶切，会产生不同长度的片段，在凝胶电泳时呈现不同的带型。PCR-RFLP是指先以PCR快速而有效的扩增微量的DNA，再利用限制酶进行多态性分析的实验方法。Fenaux M等利用PCR-RFLP对PCV-1和PCV-2进行检测和定型[8]，利用仅在PCV-2上有的限制性酶切位点Nco I来鉴定PCV-1和PCV-2。PCV-2的PCR产物被切成两个片段，而因PCV-1上无Nco I的位点不能被Nco I切割。经电泳分析，PCV-1的酶切片段仍是243 bp，而PCV-2的酶切片段是168 bp和75 bp。
5 IHC检测
免疫组织化学技术（IHC）是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质（抗原/抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术,即预先将抗体与酶连接，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。免疫组织化学技术十分适合于病毒和病毒抗原在组织培养和机体细胞内的生长繁殖定位的观察。Kawashima K等应用组织病理学和IHC方法检测仔猪PCV-2的感染，并检验了地塞米松在发病机制中的作用[9]。近年，Kim J等用IHC从流产胎儿和死产仔猪的巨噬细胞中检测出PCV-2病毒的抗原[10]。
6 ISH检测
核酸杂交是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键形成稳定的杂交双链。原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交，属于固相核酸分子杂交的范畴，但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。McNeilly F（1999）应用ISH成功地检测猪圆环病毒，并与免疫组织化学试验进行对比。作者用蛋白酶XIV处理标本，发现特异性信号增强，而且组织形态没有被破坏。用IHC和ISH检测PMWS的组织切片，可以观察到PMWS特异性的病理组织学变化，浸润的单核细胞可检测到PCV的抗原和核酸。近年Kim等用ISH检测了PCV-2的病毒DNA[10]。
7 小结
PMWS严重影响断奶猪的生长发育,给养猪业的生产和发展造成严重的影响。国外对PCV的诊断技术方法进行了大量的研究，已建立了多种方法成功地检测PCV的抗原、抗体和核酸。国内对PCV的研究还处于起步阶段。我国是一个养猪大国， PMWS已在我国广为流行,而我国对PCV病认识不足，尚未确立标准的诊断方法，当务之急是建立一套完整的检测PCV的方法，及早开展PMWS的调查和防制研究。（胡 哲1，冷 雪1，崔晓华1，史纪新2，胡桂学11.吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春 130118;2.万犇乳业有限公司，吉林长春 130033）