猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展

　　摘 要：猪繁殖与呼吸综合征是一种引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状及高死亡率的传染病。已几乎遍极世界所有养猪国家，在中国的流行和分布也日益广泛，危害日益严重。此病的传播给世界养猪业造成严重经济损失，受到国内外学者的高度重视,对此病的研究也正在逐渐深入，特别是免疫学及其疫苗的研究正日益受到关注。文章就猪繁殖与呼吸综合征病毒的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗的研究进展和使用现状做了系统地阐述，特别是通过合理地选择和使用免疫佐剂，如γ干扰素、霍乱毒素及可溶性β葡聚糖等来改进疫苗作用方面进行了阐述。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征；猪繁殖与呼吸综合征病毒；疫苗

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）于1987年首次在美国发现以来，各国相继发生流行性感染，目前，已几乎传播到世界所有养猪国家，给世界养猪业造成严重的经济损失。由于此病没有特效治疗药物，人们更重视其免疫机理及其疫苗的研究，并取得了较大进展。现就PRRS的疫苗研究进展情况做如下介绍。
1 灭活疫苗
PRRS灭活疫苗具有安全、不存在散布病毒和造成PRRS新疫源的危险、便于贮存和运输、对母源抗体的干扰作用不敏感等优点，因此人们首选灭活疫苗来预防和控制PRRS。西班牙的Cyblue灭活疫苗，可提高母猪的繁殖力，改善死胎状况[1]。Plana Duran等[2]报道应用西班牙毒株研制成一种灭活疫苗，对后备母猪和母猪进行两次基础免疫，起到保护作用。加拿大Rogan D等的研究表明，用PRRS灭活疫苗免疫猪后，可刺激猪产生特异性抗体，可减少病毒血症的发生，有效阻止肺部病变。
国内分离的PRRSV CH-1a株制成油佐剂灭活疫苗，接种猪后20 d左右，抗体达到高峰，并可持续6个月左右，攻毒后免疫组产仔率明显高于非免疫对照组，表明该疫苗安全有效。利用国内分离的野毒株（SI毒株）研制出油佐剂灭活疫苗，对仔猪接种一次，保护期可达6个月以上，后备母猪和公猪接种2次，可提供终生保护。Nilubol D等[3]用灭活疫苗接种PRRSV感染猪，并对接种猪的病毒血症和中和抗体情况、口咽刮取物和γ干扰素（IFN-γ）分泌细胞情况进行了检测，尽管不影响病毒排出，但接种猪的中和抗体滴度和IFN-γ分泌细胞都有明显的升高。
2 弱毒疫苗
PRRS弱毒疫苗具有免疫力坚强、免疫期长等优点，但人们在使用弱毒疫苗时极为慎重。在欧洲（如德国）禁止用活疫苗来预防PRRS，主要采取捕扑的方法净化猪群；美洲和亚洲国家提倡在未发生PRRS的猪场中避免使用弱毒疫苗，弱毒疫苗可用在存在PRRS的猪群。Joo H S等[4]报道，弱毒疫苗适用于3周龄～18周龄的猪，接种疫苗后，可在7 d内产生免疫力，并至少在16周内可提供有效的保护。
ScheringPlough推出的Prime Pac PRRS减毒疫苗，可用于母猪或后备猪配种前3周～6周时的预防接种[5]。Benfield D A等[6-7]测定出生前的胎猪和出生后仔猪的体重及增重情况表明，妊娠母猪接种弱毒疫苗对随后的强毒(NADC-8)攻击产生了一定程度的保护。同时也证实了同源株免疫保护的完全性，而NADC-8株子宫内接种对异源株(Lelystad株)攻毒仅提供有限的保护性免疫。沈强等用克隆纯化的PRRSV弱毒株接种乳猪、妊娠母猪，证明是安全的。
Mengeling等报道了一种弱毒疫苗，怀孕后期接种后可产生病毒血症，但对接种母猪是安全的，对胎儿没有或只有轻微的直接影响。韩国学者比较了韩国野毒株及疫苗样毒株的致病性及其在组织中的分布情况，两组怀孕母猪在产前2周分别感染野毒及疫苗样毒，结果疫苗毒组提供了一定的保护[8]。
PRRSV疫苗的有效性受PRRSV基因多样性的影响。Labarque G等[9]用LV株弱毒疫苗去研究对不同基因簇的欧洲型野毒的保护作用，攻毒后定期检测支气管肺泡洗出液及血液，结果从空白对照组和基因型不同的实验组中检到病毒，LV组未检到病毒。Mengeling W L等[10]用不同毒株的强弱株进行免疫及攻毒试验，定期检测病毒情况，结果只有异源攻毒组分离到病毒，这种毒株免疫排斥具有显著的统计学意义，确定了PRRSV选择毒株免疫反应的株特异性。Joo H S等[4]通过检测攻毒后病毒血症的减轻程度，比较了美洲血清型和欧洲血清型弱毒疫苗抗3种欧洲野毒株攻击的效果。在接种后4周攻毒，用同血清型病毒攻毒，产生的PRRSV特异性抗体平均效价均远高于异血清型病毒的攻毒情况；攻毒后，对照组猪PRRSV特异性抗体均为阴性。这种弱毒疫苗对同源免疫的保护高于对异源免疫的保护，也在其他实验中得到证实。这些研究成果在疫苗开发上会有启发。
弱毒疫苗在提供免疫保护的同时，还会持续散播疫苗病毒，使得病毒在猪场中循环存在，有时甚至引发PRRS的暴发，这一事实早已在丹麦得到证实。实验证明，PRRSV感染诱导B细胞的增生的同时，也导致这些猪免疫损伤[11]。Nielsen J等[12]用从胎儿、死胎及死亡小猪中分离的疫苗源毒感染晚期怀孕母猪，证明疫苗源毒能在猪群中持续存在，并引发疾病。
Mengeling W L等[13]证明，免疫单株疫苗和多株疫苗在攻毒后都获得了高水平的免疫保护，但免疫多株疫苗的猪，无论是否进行攻毒都出现了淋巴结的明显肿大，所以多株疫苗在使用之前需要进行安全性研究。
3 基因工程疫苗
3.1 核酸疫苗
由于核酸疫苗可同时诱导细胞免疫和体液免疫，且对不同血清型的毒株具有交叉保护性，因此核酸疫苗有望成为重要研究方向。Jiang P等[14]用致弱的沙门氏菌携带含有PRRSV GP5基因的真核表达质粒(pcDNA3-GP5)在体内诱导了GP5的特异性免疫，在肠上皮检测到GP5蛋白，在血中检测到相应的中和抗体，这说明口服接种途径能诱导PRRSV体液免疫反应，沙门氏菌可作DNA疫苗的口服传递者。Verheije M H等[15]对源于Lelystad毒株cDNA的3个引入突变的重组体vABV 688、vABV 707和vABV 746进行安全性及有效性试验，引入突变位点的重组体免疫8周龄小猪，基因组突变体能保持在整个的病毒血症时期。用突变重组体免疫猪产生的病毒血症程度比免疫非突变重组体vABV 437的猪低，且持续时间短。二者都能保护同源毒的攻击，并保护病毒的晚期传播，但不能保护异源毒的攻击。
另外，“自杀性”DNA疫苗也在PRRSV上有所探究。方六荣等[16]在表达载体pSFA1的基础上构建了含ORF5基因的“自杀性”DNA疫苗（pSFV-CMV-SV-ORF5），用之接种猪2次，间隔4周，采血测定中和抗体和CTL活性。结果“自杀性”DNA疫苗无论在诱导中和抗体还是细胞免疫方面均优于相应的常规DNA疫苗。
3.2 重组疫苗
PlanaDuran J等[17]报道，用西班牙Olot/91株ORF3的杆状病毒表达产物接种怀孕母猪，保护率达到68.8%，这说明GP 3具有抗原性，并可诱导细胞免疫。同年，其又用纯化的GP 2、GP 3、GP 5和N蛋白进行怀孕母猪免疫保护试验，结果重组GP 3和GP 5免疫组对强毒的保护率分别为68.4%和50%[2]。Kreutz等也应用杆状病毒表达GP 3和GP 5，初步试验表明重组疫苗可产生显著保护。Persh S等[18]报道用杆状病毒表达的E蛋白接种猪后，可检测出抗PRRSV的中和抗体；用杆状病毒表达的GP 3免疫甚至可诱导产生比用E蛋白免疫更高的保护作用。并发现通过重组的GP 3-E蛋白免疫可获得最强的保护作用。
3.3 活载体疫苗
Balasuriya U B等[19]在研究马动脉炎病毒(EAV)的活病毒载体疫苗时发现，ORF5与ORF6共表达的重组病毒疫苗能诱发很强的体液免疫与细胞免疫反应，并能抵抗强毒攻击。方六荣等[20]以伪狂犬病毒基因缺失标志疫苗株TK-/gG-/LacZ+为亲本株，通过同源重组，构建了表达PRRSV主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+。将重组病毒免疫Balb/c小鼠，2次免疫后4周，50% (3/6)小鼠产生了低水平的GP 5特异性ELISA抗体。Reginaldo G B等[21]用卡介苗（BCG）表达GP 5顶端缺失的重组体（rBCGGP5）及M蛋白重组体(rBCGM)免疫猪，接种30 d后，重组卡介苗免疫组产生了特异性的体液免疫反应，接种60 d后检到中和抗体，也检测到抗卡介苗抗原的IFNγ反应，建立起了对PRRSV的部分保护。
4 PRRSV疫苗的改进
为提高PRRS疫苗的安全性及有效性，对免疫佐剂和免疫方式进行合理的优化选择会收到较好的效果。
为了同时提高对同源和异源PRRSV攻击的更好保护，可用细胞因子作为PRRS疫苗佐剂。研究表明，在接种PRRS疫苗时，加入外源性IFN-α对促进Th1免疫应答的产生有重要影响[22]。α型干扰素在体内天然的抗感染及抗病毒中起着重要的作用，它们可通过多种机制对把天然免疫和适应性免疫联系起来发挥着重要的作用。所以病毒感染的结果可通过对干扰素的诱导及干扰素对病毒反应的敏感性表现出来。用弱毒疫苗诱导的IFN-β反应较弱，为了提高免疫反应，Meier W A等[23]将编码IFN-γ或IL-12的质粒佐剂同弱毒疫苗共同使用，在佐剂实验组中观察到原始病毒3倍的特异性IFN-γ反应，而且这种反应在6周时仍很明显，这种效应也出现在基因有差异的PRRSV攻毒组上；而应用IL-12质粒实验组中，这种作用则是短暂的（1周）。可见IFN-γ诱导的ThⅠ型反应明显增强，这种干扰素能够用在抗PRRSV的疫苗免疫程序中。
经口投递的霍乱毒素（cholera toxin，CT）是较好的黏膜佐剂和免疫原。为了确定口服免疫是否还能在远端的黏膜表面诱导免疫反应，Hyland K等[24]检测了口腔及生殖道对霍乱菌素B亚单位(CT-B subunit，，CT-B)的抗体反应。结果从唾液及阴道的分泌物中检测到了CT-B抗体，而与CT基因融合表达的PRRSV核衣壳蛋白可诱导产生局部的黏膜抗体，在远端的阴道分泌物中未检测到抗体。这表明口服CT诱导针对猪繁殖病原的免疫是可行的，然而有效诱导生殖道特异性免疫的机制需要进一步研究。为验证炎性细胞因子和细菌内毒素能否作为佐剂危险信号刺激导更强烈的免疫应答，Foss DL等在用弱毒疫苗接种猪1周内，同时注射IL-1、IL-6、IL-12或CT，结果表明，IL-12可增强对PRRSV的IFN-γ应答，影响对抗原特异性T细胞应答的诱导；接种CT佐剂的猪只产生较强的针对GP 5的抗体反应（抗体产生时间更早，持续时间更长），表明CT是有效的黏膜佐剂，特别是对于抗体反应；没有迹象表明PRRSV对其他它无关抗原（包括圆环病毒）产生免疫抑制[25]。
XiaoZ G等[26]通过检测感染PRRSV的4月龄猪的外周血单个核细胞发现，可溶性β-葡聚糖通过增加IFN-γ分泌细胞来增强抗原依赖性细胞免疫反应，而不溶性葡聚糖则没有增强抗PRRSV的天然免疫应答的功能。Chung H K等[27]用感染韩国分离株的猪肺组织进行cDNA探针杂交分析，在肺中检测到IFNα及Mx1（myxovirus resistance 1）蛋白，到7 d达高峰，然后迅速下降。IFN-α及Mx1蛋白的杂交信号通常与炎症有关，尤其是在肺泡巨噬细胞中更是这样。在感染PRRSV但未受损伤的肺及标准对照组的肺中，IFNα及Mx1蛋白的表达都呈阴性。这一结果表明，IFN-α及Mx1蛋白在抵御早期PRRSV感染中发挥重要的作用。
总之，PRRSV的免疫学及疫苗研究取得了很大进步，但PRRSV的免疫学机理还未完全弄清楚，开发出安全有效的PRRSV新型疫苗仍然是今后努力的方向。