摘 要：近几年禽流感的大范围流行，不仅给养禽业造成了巨大的经济损失，而且由于禽流感可直接感染人并导致死亡，故对人类健康也带来严重的威胁。疫苗免疫仍然是防止禽流感暴发的主要措施，但禽流感病毒变异性强，血清型众多，给疫苗的研究带来极大困难。就目前而言，能在实践上应用的禽流感疫苗主要还是灭活疫苗，这种疫苗具有亚型特异性，但也正是这种特性限制了这种疫苗的发展。随着生物技术的快速发展，其他新型疫苗尤其是基因工程疫苗的研究也取得了一定的进展。使我国应用禽流感疫苗，预防高致病力禽流感的防制策略成为可能。文章就目前禽流感疫苗的研究方面介绍了国内外的一些研究进展。
关键词：禽流感;养禽业;疫苗
禽流感(Avian influenza,AI)是由流感病毒引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病，是危害禽类健康的重要传染病之一。禽流感病毒的抗原非常容易变异，这是禽流感反复流行的重要原因，这种易变性主要由以下因素造成：禽流感病毒存在多种亚型，在特种条件下会跨越种属界限而传染到人；A型流感病毒的基因由8个节段组成，当不同亚型同时感染时，会造成病毒之间的重组而导致新亚型的出现；病毒的RNA聚合酶缺乏校对功能，核酸复制过程中容易发生突变，在机体免疫压力选择下会发生抗原漂移。流感的流行程度和破坏性与病毒的抗原性变异直接相关，当新亚型的病毒出现时，会导致世界范围的大流行，对养禽业及人类社会造成严重的危害。
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的多型性给防制禽流感带来极大难度，2004年初在越南流行感染人的H5N1再一次给人类敲响了警钟。国内外的禽流感防制实践表明，疫苗免疫是防止禽流感暴发和造成巨大损失的主要措施、关键环节和最后防线。
20世纪末生物技术的飞跃发展，促进了疫苗学的形成与发展，以疫苗等生物制品为中心的生物技术研究已经成为全球发展最快的领域之一，而疫苗学在预防禽流感中所起到的作用也是世人所瞩目的。目前，应用的禽流感常规疫苗主要是灭活苗。20年来，灭活疫苗的制备技术不断改进，并已经广泛应用于禽的免疫，大量的临床试验已证实其可以有效地阻止临床发病和死亡。但是这种疫苗的制造方法、免疫程序及免疫效果的可靠性，大面积应用的可行性及动物安全性，均存在不少缺点，而且其制造成本高，免疫保护期短，需反复接种。随着禽流感病毒多种亚型的发现以及基础免疫学理论、分子生物学及其生物技术的发展，以往疫苗的研制技术和生产方法以及研制所依据的免疫学基础，都在一定程度上无法适应病毒的新发现和新进展所需。在研究领域和应用领域中出现的各种问题都需要在整个理论与技术层次上有所突破和提高。大量的新型疫苗由此而生，所谓新型疫苗即利用基因重组、基因表达、DNA合成等技术，加速致病抗原的分离与鉴定、致病微生物的修饰与改造，促进疫苗生产技术的发展。
1 灭活全病毒疫苗
在灭活疫苗的研究中发现，疫苗中血凝素抗原的含量是疫苗免疫效果的决定性因素。Schild等发明的SRD试验20多年来一直被作为流感病毒灭活苗中血凝素抗原含量测定的标准方法。目前，我国H5、H7亚型禽流感灭活疫苗已经研制成功，并取得了良好的免疫保护效果。试验表明，仔鸡免疫接种AI灭活苗后7 d产生免疫力，其保护率为80％，10 d保护率为95％，14 d保护率达100％，21 d血凝抑制(HI)抗体达到高峰，仔鸡接种后最高HI抗体几何平均滴度(GMT)为7．3 log2~8.0 log2，蛋鸡为8.0 log2~10.5 log2，接种后180 d抗体效价不低于6.5 log2，以同型AIV攻击的保护率仍可达100％[1]。王红宝等[2]用禽流感H9N2株为毒种，接种SPF鸡胚增殖病毒，收取尿囊液，经甲醛灭活后，制成油乳剂灭活苗，试验证明，免疫效果良好。然而，禽流感灭活疫苗的保护效力具有亚型特异性，而禽对已知的15种HA亚型都易感，且人们无法预测什么时候家禽会感染哪一个亚型，因此使用预防性疫苗来阻止所有可能的亚型禽流感的发生是不现实的。同时，灭活的禽流感疫苗使用的抗原为全病毒，这样就给以后的禽流感疫情检测带来了难度。
2 亚单位疫苗
是用病毒的保护性抗原制成的疫苗，提取AIV具有免疫原性的蛋白，辅以佐剂而制成亚单位疫苗，这种疫苗具有很好的安全性，能刺激机体产生足够的免疫力。谢快乐等用H8N4的HA和NA制成了免疫复合物亚单位疫苗，接种动物后，HI的升高比灭活油佐剂疫苗明显。Kodihalli S等[3]研制了火鸡H5N2病毒HA和核蛋白(NP)复合亚单位疫苗，可以对同源和异源亚型病毒的攻击产生保护作用。但常规制备亚单位疫苗的过程复杂，成本高，而用基因工程表达可以获得大量的抗原蛋白，用这种方式生产的抗原蛋白不仅产量高，免疫原性好，而且成本低。Crawford J等利用重组杆状病毒表达系统生产H5、H7的含佐剂HA亚单位疫苗，接种1日龄雏鸡，然后用致死性禽流感病毒攻击，结果显示，所有接种鸡不发病，未接种组全部死亡[4]。Johansson BE等采用杆状病毒系统表达了禽流感病毒HA和NA蛋白，纯化后制备单一成分的亚单位疫苗，接种小鼠能产生较高的抗体水平[5]。但是由于禽流感病毒的HA极容易发生抗原变异，而M2蛋白是禽流感病毒的跨膜蛋白，它含有高度保守的抗原决定簇。Treanorl J J等研究表明，M2抗体在小鼠体内能够抑制流感病毒的复制[6]。因此，利用M2来研制具有交叉保护作用的亚单位疫苗是一种有效预防流感病毒的措施，是今后开发研究疫苗的一种新思路。
3 重组活裁体疫苗
是应用无病原性或弱毒疫苗株病毒，例如鸡痘病毒、火鸡疱疹病毒、鸡马立克病毒等弱毒疫苗株作为载体，插入外源性保护基因，构建重组活载体疫苗。由于外源基因已是载体病毒“本身”成分，其所引起的免疫应答，常不低于完整病毒相应成分引起的免疫强度，而且各成分之间一般不发生相互干扰或排斥现象，又因可以同时插入几个外源基因，一苗防多病，故是当前认为最有开发和应用前景的动物疫苗。HA是禽流感的保护性抗原，它不仅诱导机体产生针对HAl和HA2的抗体，而且诱导CTL反应，利用对禽类致病性很弱的病毒作载体，构建表达HA的重组病毒，用此重组病毒作为疫苗，它可在鸡体内复制，并不断地表达出HA蛋白，从而诱导机体产生针对AIV的免疫保护力。其中，采用H5亚型血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，经杆状病毒表达，构建了H5亚型基因重组杆状病毒昆虫细胞表达的疫苗，初步动物试验结果已显示出良好的免疫保护原性；以脂质体转染技术构建了H7亚型禽流感病毒血凝素基因重组鸡痘病毒，并对其进行了免疫保护研究，结果表明，H7亚型AIV的HA基因重组禽痘病毒可诱导鸡产生有效的免疫保护反应，肠道排毒显著减少[7]。乔传玲等进行了禽流感重组禽痘病毒rF-PV-HA-NA活裁体疫苗的研究，证明这种疫苗是一种安全、高效的基因工程疫苗，它有望在不久的将来替代全病毒灭活疫苗用于高致病力禽流感的预防[8]。Thomasm等将A／Ty／Irel370／83(H5N6)株的HA基因插入含有痘苗病毒WR株TK基因的质拉pSCll中，通过同源重组获得Vac-H5重组病毒。用此重组病毒接种1日龄和5日龄的仔鸡，结果可对不同H5亚型的强毒株攻击产生近100％的保护[9]。
4 DNA疫苗
又称为基因疫苗或核酸疫苗，DNA疫苗是20世纪90年代兴起的新型疫苗，已在禽流感防制方面显示出极为光明的前景，与普通蛋白质疫苗不同，DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，这种蛋白较之在原核生物表达系统中产生的蛋白更像天然分子，其递呈过程与自然感染十分相似。与其他疫苗相比， DNA疫苗免疫效果好，对已有免疫力的个体接种仍可起作用，且免疫应答持久，很微量的抗原即可刺激机体产生强而持久的免疫应答，不存在散毒及毒力回升的危险，而且DNA疫苗易于构建，方法简便、价格低廉、用量少，便于贮藏和运输，使用也较为方便。另外，DNA疫苗只对表达的抗原而不对载体产生免疫应答，故同一质粒可用于转运不同的靶基因而多次使用，也可在一个载体上构建能表达多种抗原的多功能疫苗，达到一次免疫能获得与多次免疫相同的效果。与其他疫苗相比，DNA疫苗无疑是安全有效的，它不仅具有减毒活疫苗既能诱导体液免疫应答又能诱导细胞免疫应答的优势，而且还具有亚单位疫苗的安全性，因此是当前疫苗研究的一大热点。
目前，我国研制的H5亚型血凝素基因DNA疫苗，具有良好的免疫原性，肌肉注射途径即可达到对同源强毒攻击的免疫保护，并能有效阻断免疫保护存活鸡机体的排毒[10]。国内研制的H7亚型血凝素基因DNA疫苗，在极小的剂量下即可成功诱导免疫保护反应，并有效阻断同源低致病力禽流感病毒在机体内的感染和排毒[11-12]。美国Webster R G等最近用核酸疫苗免疫鸡，预防H5、H7禽流感，实验表明，在H5亚型流感病毒之间，DNA疫苗交叉保护性好，免疫后检不出抗体，而攻毒后出现高滴度的抗体，表明活化的T细胞是DNA介导免疫保护的主要机制。
彭金美等研究的多表位DNA疫苗是建立在常规DNA疫苗基础上的一种新型疫苗，它是用表位作免疫原，这样就比较容易在一个表达载体上克隆病原体的多个抗原基因中具有免疫活性的部分。结果表明，所构建的多表位DNA疫苗能够诱导机体产生特异性免疫应答，并在同型禽流感强毒攻击时对鸡只提供一定的保护[13]。Kodihalli等(1997)将编码H5-HA的质粒DNA以0．25，0.5，1.5 μg或10 μg用基因枪免疫鸡，4周后以100 LD50的Ty／lre ／83株鼻内免疫进行攻击，低至0.25 μg剂量的DNA可使50％的免疫鸡存活；而1.5 μg，10 μg的剂量可完全抵抗致死剂量病毒的攻击；DNA疫苗对致死剂量的抗原变异株也可提供95%的保护，证实DNA流感疫苗具有广阔的发展前景。
由于大部分A型流感病毒存在于野鸟中，这些病毒很有可能将继续导致商品禽的感染，而只有合理使用疫苗，才有可能减少禽流感的传播和降低家禽对流感病毒的敏感性，这样在疾病扩散和流行之前方可实施控制措施。但是当前禽流感疫苗的应用主要还是灭活疫苗，其他类型的疫苗虽然有所发展，大部分仍处在实验室研究阶段，离临床应用还有一定的距离。而基因工程疫苗的基础性研究，为将来开发与应用禽流感疫苗奠定了技术储备，使我国应用禽流感基因工程疫苗，预防高致病力禽流感的防制策略成为可能。