摘 要：猪水肿病主要发生于断奶后2周内的仔猪，是常见的一种急性致死性传染病。该病是由利用其菌毛（F18ab）黏附于小肠上皮细胞，并产生类志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）的产类志贺毒素大肠埃希菌引起的一种肠毒血症。仔猪断奶后的免疫能力，营养水平和遗传抗性是导致猪水肿病的主要影响因素。文章着重阐述了猪水肿病的致病机理，为该病的预防和治疗提供了重要的理论依据。
关键词：猪水肿病；产类志贺毒素大肠埃希菌；致病机理
猪水肿病（Edema disease of swine, ED）是仔猪常见的一种急性致死性传染病，主要由某些特定血清型产类志贺毒素大肠埃希菌（Shiga-like toxin Escherichia coli, SLTEC）引起，以神经症状和全身水肿，特别是胃大弯，肠系膜及脑部水肿为特征。主要发生于断奶后2周内仔猪，小至数日龄，大至4月龄也偶有发生。采食量大、生长快、体况健壮的猪最为常见。该病呈地方性流行，或零星散发。引起该病的大肠埃希菌常见的血清型有O138，O139和O141等，其中以O139最多[1]。但是，各地区流行的血清型不尽相同，所以了解ED的流行血清型对防治该病非常重要。本病发病率虽不高，通常为10%～35%，但病死率高达90%。有些猪在急性感染后可痊愈，但表现为发育迟缓，造成饲料回报率低，给养猪业带来很大的经济损失。
猪水肿病的致病机理分为3个阶段，即致猪水肿病大肠埃希菌感染易感猪后，细菌以其F18ab（F107）菌毛黏附于小肠上皮细胞，造成小肠上皮细胞的损害，引起仔猪腹泻，同时在肠道内定居和增殖的细菌产生类志贺样毒素Ⅱ型变异体(Shiga-like toxin Ⅱe,SLT-Ⅱe)并被吸收，导致感染猪出现水肿和神经症状[2]。F18ab菌毛与SLT-Ⅱe是致仔猪水肿病的SLTEC 2个主要毒力因子[3-4]。
1 染ED的影响因素
ED的发生与饲料和饲养方法的改变、气候变化、母源抗体保护的丧失、畜群的易感性等有关，尤其是仔猪的免疫能力、营养水平和遗传抗性这3个主要方面。此外，轮状病毒、流行性腹泻病毒、球虫、隐孢子虫和其他细菌病原体等病原也是很重要的诱发因素。
1.1 疫能力
ED主要发生于仔猪断奶后1周～2周，但断奶前或断奶后数周也偶有发生。Sarmiento J I等(1988)在猪乳中检测到了特异的抗体，并指出在整个哺乳期间只要能吃乳，乳中的抗体就能防止大肠埃希菌的定植[5]。猪乳富含IgA，为哺乳仔猪胃肠道黏膜起局部免疫保护作用。Main R G等[6]研究表明，增加仔猪断奶日龄有利于提高仔猪多点生长性能。一旦仔猪断奶，保护仔猪免受致病菌侵袭的母源抗体IgA逐渐减少，肠道抵抗细菌增殖的能力下降，加上饲料和饲养方式的改变，都有利于肠道细菌的感染，从而导致猪水肿病的发生。
1.2 养水平
饲料的营养成分也是一个重要的影响因素。饲料中蛋白质的含量过高、粗纤维的含量不足、饲料成分急剧改变、过饱和缺硒等都与发病有关[7]。因此，ED被命名为“蛋白质中毒”[5]。Smith H W和 Halls S（1968）给采用不同饲料配方的猪接种一株血清型为O141∶K85ac的大肠埃希菌，发现限饲的猪发病少且粪便中的细菌含量低。自由采食高纤维低养分饲料的猪也得到了相似的结果，研究人员推论，也许是小肠上皮的生理状态影响了细菌的黏附。Bertschinger H U等（1978）以1株血清型O139∶K12的大肠埃希菌接种，证实了Smith H W和Halls S的结果。张心如等（1994）用2种不同蛋白质水平的玉米豆饼型饲粮饲喂仔猪（7日龄诱食，35日龄断奶，60日龄结束试验），结果为18%蛋白质饲粮组断奶后腹泻发生频率较23%蛋白质饲粮组低48.55%，ED发病率降低44.88%，日增重和饲料利用效率分别提高10.2%和6.67%。仔猪断奶后3周内饲料蛋白质的含量不应高于19%，同时适当补充富含维生素的饲料。
饲料中蛋白质的含量过高容易导致仔猪水肿病，其原因在于仔猪消化功能不健全，胃酸分泌少，消化酶活性低。仔猪断奶前，胃的酸性环境主要依靠奶中的乳糖发酵生成乳酸；仔猪断奶后，乳酸来源终止，这时盐酸的分泌仍很少，而饲料中蛋白质和无机盐阳离子与酸结合，更加使得胃酸度下降，胃蛋白酶活力下降，使得蛋白质不能被有效地消化吸收，消化过程生理失调，大肠中存在大量未被消化的蛋白质和未被吸收完全的氨基酸，导致肠道微生物菌群区系不平衡，从而使肠道微生物以大肠埃希菌等糖蛋白水解菌为主。
1.3 遗传抗性
畜群的易感性由畜群的遗传特征所决定，有些畜群天然的对ED不敏感。仔猪对该病原的易感性取决于小肠黏膜上皮细胞上是否存在F18菌毛的受体以及是否具有显性遗传特性。大肠埃希菌黏附于小肠黏膜上皮细胞具有宿主特异性，猪源菌株大肠埃希菌黏附于猪小肠黏膜上皮细胞系IPEC-J2，而人源菌株则黏附于人小肠黏膜上皮细胞系T84和HCT8[8]。
F18菌毛受体的表达与否可以用来区分易感猪和具有抵抗力猪。并非每头猪小肠上皮细胞都有大肠埃希菌的刷状缘受体，但是绝大多数品系的猪都可表达F18菌毛的受体。在对一瑞士猪占主体的猪群调查表明，对应激的抵抗力与是否易被F18菌毛大肠埃希菌的黏附有关。菌毛受体可能是一种糖基化受体，可用含豆科植物饲料中的植物凝集素加以调节。F18受体在20日龄以下的猪还未完全表达，这就解释了为何有F18菌毛的大肠埃希菌不引起新生仔猪的疾病[5]。Imberechts H等（1997）研究表明，仔猪对产F18菌毛的致ED大肠埃希菌的易感性随着年龄的增长而增加。
Vogeli P等[9]认为，引起ED F18菌毛受体基因位于第6号染色体上，细菌黏附的敏感能力决定于ECF18R位点的显性等位基因（B），抵抗力则决定于隐性等位基因（b）。Vogeli P等（1996）对236头猪进行了试验，将这些猪分成14个血统和11个生化多肽性组，对F18菌毛受体编码基因做了系统的研究，大肠埃希菌F18菌毛受体基因位点ECF18R与控制猪应激敏感性的S基因，控制血型多肽性的RYR1，GPI，EAH，A1BG，PGD基因位点最可能的排列是S-ECF18R-RYR1-GPI-PGD或GPI-RYR1-ECF18R-S-PGD。
对于细菌黏附和水肿的遗传抵抗力的研究，有可能培育出对水肿病有抵抗力的抗病品种。
2 F18菌毛黏附于肠道
仔猪断奶后，母源抗体保护的丧失，饲料和饲养方法的改变，气候变化等因素，可导致机体抵抗力的下降。在这种条件下，产F18菌毛的SLTEC可利用F18菌毛黏附于猪小肠黏膜上皮细胞微绒毛或刷状缘F18受体，从而在肠道内定居并大量增殖。
2.1 F18ab的发现
Smith H W等（1968）证实了仔猪口服感染O141∶K85大肠埃希菌后，发现这种大肠埃希菌在肠道中增殖，血清型相同，并且在肠壁上的细菌数量超过了肠道内容物中正常细菌的数量。研究认为，细菌在肠道中的增殖能力与其吸附于肠上皮细胞的能力有关[2，10]。Methiyapun S等（1984）电镜研究表明，肠道上皮上有连续数层和广泛的细菌分布。细菌主要吸附于肠绒毛的末梢，而和未注射细菌的对照组相比，肠细胞的形态学特征略有变化。Bertschinger H U等（1990）在研究2株致水肿病大肠埃希菌(O139∶K12∶H1)菌株107/86及124/76的生物学特性时,发现它们感染猪体内时能吸附于猪肠上皮细胞刷状缘。生长于绵羊血平板上的107/86菌株,37 ℃时能产生大量长而易弯曲的非血凝性菌毛,直径约为4.6 nm，18 ℃时不表达菌毛。该菌毛抗原性与当时已知的K88，K99，987P和F41等菌毛均不同,命名为F107,现已被正式命名为F18ab。
2.2 F18ab的作用机制
F18可介导大肠细菌对小肠细胞的黏附，利于其定居并大量繁殖。Rippinger P等[11]根据F18的抗原性，将其分为2个抗原变种——F18ab和F18ac。与致ED大肠埃希菌SLTEC相关的F107菌毛属于F18ab，产F18ab菌毛的大肠埃希菌在体内外均能很好的吸附于断奶仔猪肠上皮细胞或刷状缘细胞，且此吸附特性不被甘露醇所抑制。与致断奶仔猪腹泻大肠埃希菌ETEC相关的2134P，8199和8133菌毛属于F18ac[12]。利用单抗和多抗同时检测F18ab和F18ac，表明两者有部分相同的抗原决定簇，命名为“a”，而将在F18ab和F18ac菌株上各自特异的决定簇分别命名为“b”和“c”。免疫电镜表明“a”和“b”或“a”和“c”沿同一菌毛分布；分别针对共同的抗原决定簇“a”和特异性抗原决定簇“b”或“c”的抗血清，在免疫印迹试验中均可识别分子质量约为15 ku的蛋白条带[11]。
F18ab（F107）是报道的首个水肿病大肠埃希菌定居因子，其基因也进行了克隆。编码F18ab的基因有6个，即fedA，fedB，fedC，fedD，fedE和fedF。Imberechts H 等（1992）从107/86菌株上分离并纯化了F107菌毛，成功地克隆了F18亚基的主要亚单位基因fedA，发现一个编码170个氨基酸的开放阅读框，其中包含21个氨基酸的信号肽。fedA为513 bp，构成F18菌毛的主干。fedB，fedC和fedD编码的蛋白主要是一些与F18菌毛的合成、装配、成熟相关的伴侣蛋白或引导蛋白。fedE和fedF编码的是F18菌毛的次要结构亚单位蛋白,为F18菌毛黏附所必需并影响菌毛的长度。Smeds A等[13]利用融合蛋白对F18菌毛黏附特性做了进一步的研究，表明纯化的FedF的融合蛋白（MBPFedF）可黏附于离体猪肠上皮细胞，其抗血清则可阻断质粒pIH120转化菌HB101对离体猪小肠微绒毛的黏附作用。而纯化的FedC和FedE的基因融合蛋白及其抗血清却没有这些特性，表明fedF基因是发挥黏附功能不可缺少的因子[14]。Smeds A等[15]通过点突变进一步研究表明，FedF蛋白第60位至第109位氨基酸区域，是F18菌毛结合到猪空肠上皮细胞受体必不可少的，此区域第72位的Lys，第88位His和第89位His这3个氨基酸残基，对于高效受体结合是非常重要的。
Imberechts H等（1997）通过提纯F18ab免疫母鸡，制备F18ab卵黄抗体，在体外黏附试验中，这种卵黄抗体能抑制F18ab+细菌对肠黏膜的吸附。同时还进行动物感染保护试验，分为2个组，一个组的日粮中加有F18ab卵黄抗体，而另一组则为普通日粮。用 F18ab+ 大肠埃希菌感染易感断奶仔猪，试验结果显示，日粮中加有F18ab抗体的那组，F18ab菌株排泄明显低于对照组，并且腹泻及死亡率也明显下降。
3 SLT-IIe发挥毒性作用
3.1 SLT-IIe的发现
Timoney F（1950）将发生水肿病的肠道内容物离心后的上清静脉注射仔猪，可复制出水肿病，因而证实了水肿病不是由细菌直接引起的，而是其产生的一种毒性物质引起的，这种毒性物质存在于患病猪的肠道中。仔猪静脉注射致ED的大肠埃希菌抽提物后，24 h～48 h就出现了水肿病的临床症状，口服感染后约1周才出现临床症状，这表明致ED大肠埃希菌在消化道内产生了一种毒素。毒素作用的扩散依赖于宿主的吸收，因此认为仔猪水肿病是一种肠毒血症。Erskine R G等（1957）将体外培养的致ED大肠埃希菌反复冻融，从中抽提出一种物质，静脉注射健康仔猪，可引起与ED完全一样的症状和损伤，这个试验也证明了毒素是水肿病的主要致病因子[2，10]。
Konowalchuk J等（1977）首先发现某些大肠埃希菌产生一种能引起Vero细胞病变的毒素，并称之为VT毒素（Verocell toxin），因为这种毒素与志贺痢疾杆菌细胞毒素的生物学活性和作用方式极为相似，故称之为类志贺样毒素(Shiga-like toxin, SLT)。其与志贺样毒素Ⅰ型（SLT-Ⅰ）和志贺样毒素II型（SLT-Ⅱ）的特异性方面，SLT-Ⅰ和SLT-Ⅱ对Vero细胞和HeLa细胞都具有毒性，而水肿病毒素对Vero细胞的毒性明显高于对HeLa细胞的毒性。并且水肿病毒素比SLT-Ⅰ或SLT-Ⅱ更不耐热，不能被抗SLT-Ⅰ的血清中和，但抗SLT-Ⅱ的血清却能中和该毒素。因此，水肿病毒素被命名为类志贺样毒素Ⅱ型变异体（Shigalike toxin Ⅱ variant, SLT-Ⅱv），现称为SLT-Ⅱe，也称为VT2e、Stx2e。断奶仔猪腹泻和ED常发生于同一猪群，并且病原菌的毒力因子也有相似之处，Chen X等[16]研究表明，产SLT-Ⅱe的大肠埃希菌主要与ED有关，而致断奶仔猪腹泻大肠埃希菌只有25%是SLT-Ⅱe阳性。
Macleod等（1991）建立了一种毒素纯化的最佳方案，用此方案可制备出无内毒素的SLT-Ⅱe均质的制备物，并证实了SLT-Ⅱe毒素是由2个分子质量不同的亚单位组成，对Vero细胞具有毒性，对兔肠有微弱毒性，可致死小鼠，能完全复制出仔猪水肿病。SLT-Ⅱe的半数致死量LD是3 ng/kg猪体重。
3.2 SLT-Ⅱe的作用机制
SLT-Ⅱe是致仔猪产生水肿病的主要毒力因子，由1个分子质量为33 ku的A亚基和5个分子质量为7.6 ku的B亚基共同组成的聚合体。其中A亚基是水肿病毒素的主要毒力亚单位，为毒素的酶活性部位，具有细胞毒性作用。B亚基不具毒性，而具有免疫原性，是水肿病毒素保护性抗原的所在处[17]。A亚基的细胞毒性作用主要是通过A链的RNA-N糖苷酶活性切断28 S rRNA 5′端4 324位腺嘌呤的N糖苷键，腺嘌呤残基因此脱落，使延伸因子EF-1的氨基酰化tRNA不能与60 S核糖体亚基结合，从而阻断了细胞内蛋白质的合成，造成代谢功能紊乱，导致细胞死亡。
A亚单位具有很高的保守性[18]，包括A1和A2两个亚基，其中A1亚基是SLT-Ⅱe分子的接触反应中心，其N端存在毒素的信号肽序列，C端存在一个参与毒素分子跨内质网膜运输的跨膜区[19]。Hovde C J等(1988)通过X射线衍射技术对SLT-ⅡeA的立体结构进行观察，推测第167位的Glu及170位的Arg对维持其构象有重要作用。Gordon V M等(1992)利用点突变技术对SLTⅡeA的基因进行修饰，发现若将第167位的Glu突变为Asp，其毒力将下降104倍，酶促活性下降400倍；若将第170位的Arg突变为Lys，其毒力将下降10倍，酶促活性下降5倍；若将第167位及170位的Lys同时突变掉，其毒力将下降106倍，酶促活性下降1 500倍。
通过定点突变表明对Vero细胞受体发挥作用的氨基酸位于SLT-ⅡeB处。其不具有酶活性作用，但具有免疫原性，是水肿病毒素保护性抗原的所在处。SLT-ⅡeB能与肠上皮细胞的特异性受体结合，使SLT-ⅡeA通过“脂流”进入细胞内，从而A亚基可能发挥毒性作用。受体的化学本质已经明确。SLT-Ⅱe优先结合真核细胞的球丁糖基神经酰胺（Globotetraosylceramide,Gb4）和半乳糖红细胞糖苷酶（Galactosylgloboside，Gb5），而与球丙糖基神经酰胺（Globotriosylceramid，Gb3）亲和力较低，但志贺样毒素ShT，SLT-Ⅰ和SLT-Ⅱ仅结合Gb3。Gb3受体存在于Vero细胞，Hela细胞和仔猪肠上皮细胞上，Gb4主要存在于猪小肠上皮细胞及Vero细胞上，Gb5只发现于Vero细胞，这一点也就解释了为什么SLT-Ⅱe对Vero细胞有较强的毒性作用，而对Hela细胞的毒性较弱的现象，以及这种识别的差异可能与它们的B亚基的氨基酸序列有关[20]。猪红细胞富集有Gb4受体，SLT-Ⅱe在血液中的数量和比例，决定了上皮细胞结合SLT-Ⅱe的能力。体外试验表明，大多数SLT-Ⅱe局部活跃于猪全血样品的红细胞片段中，而在血浆中很少或不能检测到Vero细胞毒性；体内试验也表明，当静脉注射仔猪时，SLT-Ⅱe明显结合于红细胞，这可能是毒素转移到敏感组织的一种方式[21]。
为了探索SLT-ⅡeB的哪些氨基酸决定结合的特异性，Ling H等[22]利用点突变技术对SLT-ⅡeB的基因进行修饰，构建一系列SLT-Ⅱe的突变株，研究表明，同时将第65位的Gln突变为Glu，第67位的Lys突变为Gln，则发生突变的SLT-ⅡeB亚基与Gb3的结合能力强于Gb4，这说明了Gb3是Gb4的替代受体。Waddell T E等研究SLT-Ⅱe的受体在猪的机体组织中是如何分布的，结果表明在猪体的肝脏、结肠、眼睑、回肠、小脑和脑脊髓等部位的动脉都可结合SLT-Ⅱe；除肝脏外，其余5个部位的静脉也结合了SLTⅡe毒素；回肠隐窝的细胞上也结合了毒素。利用单克隆抗体进一步证实SLT-Ⅱe主要结合于这些器官组织的上皮细胞和血管平滑肌细胞上，并且证明SLT-Ⅱe可阻遏猪主动脉内皮细胞蛋白质的合成。这也说明内皮组织具有SLT-IIe的特异性受体。
MacLeod D L等用纯化的SLT-Ⅱe静脉注射健康仔猪，可引起与ED完全一样的临床症状和病理损伤，但是Waddell等单独用纯化的SLT-Ⅱe肠道内注射仔猪，却不能复制出水肿病，这可能是与毒素从肠道转移到系统维管结构需要特异性的受体有关。Waddell T E等（1995）利用脱氧胆酸钠可提高肠道吸收大分子物质的渗透性这一特性，将混有脱氧胆酸钠的SLT-Ⅱe肠道内注射仔猪，可导致仔猪出现水肿病的症状和特征病变。
Waddell T E等（1995）认为，仔猪肠道吸收SLT-Ⅱe的机制可能是特异性受体介导的转胞吞作用，肠细胞非特异性的胞吞作用，肠上皮细胞介导的非特异性转胞吞作用，细胞旁转胞吞作用，以及M细胞的抗原采样作用等方式。SLT-Ⅱe以非特异性机制吸收进入血液循环，与血管内皮细胞和平滑肌细胞上的受体结合，阻碍靶细胞的蛋白质合成，从而造成细胞的变性和死亡，引起血管通透性增强，血管内大分子物质进入组织，使组织形成高渗透压，导致水分子的大量进入，最后造成组织的水肿病变[23]。
4 结语
综上所述，猪的免疫能力低下、营养水平不当和遗传抗性是引起ED的主要影响因素。F18ab菌毛与SLT-Ⅱe是致仔猪水肿病的SLTEC的2个主要毒力因子。大肠埃希菌的肠细胞脱落位点毒力岛和强毒力岛毒力因子是近期研究的热点之一[24]。F18ab可介导细菌对小肠细胞的黏附利于其定居并大量繁殖，定居和繁殖的细菌在肠道内产生SLT-Ⅱe并被吸收。毒素的吸收首先是通过B亚基与肠上皮细胞的Gb4受体发生特异性结合，随后，A亚基进入细胞内并发挥毒性作用造成细胞的死亡和组织病变。SLT-Ⅱe也是一种血管毒素，当其被肠道吸收后，可在不同组织器官内引起血管内皮细胞的损伤和组织病变，导致病猪出现水肿和典型的神经症状。
ED的毒力因子和致病机理是目前研究较多的课题，分子生物学技术的应用对此提供了良好的手段，但是致病机理是一个比较复杂的过程，而且取决于多种因素。因此，需要在广大科研人员的不断努力下，进一步探索ED的致病机理，为今后对ED的预防和治疗提供了重要的理论依据。
参考文献（略）