关键词：鸡；大肠杆菌；沙门氏菌；混合感染；诊治
鸡大肠杆菌病是危害养鸡业的重要细菌性疾病。发病率可达30%～60%，病死率几乎达100%。我国每年因大肠杆菌病死鸡3170多万只，经济损失3亿多元禽沙门氏菌病已被国际兽疫局（OIE）列为B类传染病，以带菌蛋传播为主要传播途径。幼雏病死率10%～20%，严重者可达80%。
大肠杆菌与沙门氏菌混合感染在禽类较为常见，其中以发病率、死亡率显著增高为主要特征，从而引发更为严重的经济损失。2004年4月，兴平市西吴乡的15家养鸡场先后发病。针对这种典型混合感染病例，作者进行了较为详细的诊断，并以药敏试验为依据，提出了用沙拉沙星治疗的有效方法。
1 材料
1．1 病料
采自陕西省兴平市西吴乡农户自养的发病肉杂鸡的心、肝、脾组织。
1．2 培养基
普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、糖培养基、西蒙氏柠檬酸钠琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、硝酸盐培养基、三糖铁培养基斜面、明胶液化培养基 ，按常规方法配制。
1．3 药敏纸片
购自上海伊华医学科技有限公司（批号：20020101）。
1.4 试验动物
小白鼠8只，由西北农林科技大学实验动物中心提供；1日龄雏鸡44只，购自西北农林科技大学畜牧站种鸡场。
2 方法
2．1 流行病学调查
详细询问疫病的发病时间、发病率和死亡率，鸡群免疫情况和发病后的治疗情况。观察临床症状和病理变化。
2．2 实验室诊断
2．2．1细菌的分离培养将病料分别接种于麦康凯琼脂和鲜血琼脂平板上，37 ℃培养24 h。分别挑取不同菌落涂片、革兰氏染色、镜检。挑取不同分离菌的单一菌落，分别接种于鲜血琼脂平板做纯培养。
2．2．2两种菌的鉴别培养及形态结构观察无菌挑取血平板上两种菌的单个菌落，接种于鉴别用培养基琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板，同时分别接种于普通肉汤中，37 ℃培养24 h，观察两种菌的形态区别，及生长情况，并进行涂片、染色、镜检。
2．2．3生化试验及运动性检查分别挑取两种菌的纯培养物，接种于12种半固体糖培养基、柠檬酸钠培养基、明胶培养基和葡萄糖蛋白胨水、邓亨氏蛋白胨水、硝酸钾蛋白胨水等液体培养基中，37 ℃培养24 h。观察固体培养基的颜色变化及产生气体情况。液体培养基做MR、VP、吲哚、硝酸盐还原试验，用悬滴法做细菌运动性检查。根据结果进行细菌种属判定。
2．2．4药敏试验按纸片扩散法 操作及判定。
2．2．5致病性试验
2.2.5.1细菌总数测定 用生理盐水将两种细菌的普通肉汤培养物作10-4，10-6，10-8，10-10 稀释。取不同稀释度的菌液0.02 mL接种于麦康凯琼脂平板上，使其自然扩散，37 ℃培养24 h，计数。
2.2.5.2小白鼠感染试验8只健康小白鼠分成4组，每组2只。1组腹腔注射大肠杆菌普通肉汤培养物0.2 mL/只；2组腹腔注射沙门氏菌普通肉汤0.2 mL/只；3组同时腹腔注射沙门氏菌和大肠杆菌肉汤，每种菌0.1 mL/只；4组为对照组，腹腔注射灭菌普通肉汤0.2 mL/只。对注射后的小白鼠隔离饲养，观察其发病及死亡情况，对死亡小白鼠立即剖检，观察病理学变化。无菌采取肝、脾组织，涂片、染色、镜检，并在麦康凯琼脂上划线分离，37 ℃培养24 h，观察菌落形态、大小。
2.2.5.3动物回归试验44只1日龄雏鸡饲养2 d后，确定为健康鸡，于3日龄分4组接种细菌，每组11只。1组雏鸡感染沙门氏菌普通肉汤0.5 mL/只；2组感染大肠杆菌0.5 mL/只；3组混合感染大肠杆菌和沙门氏菌，每种菌0.25 mL/只；4组为对照组，腹腔注射灭菌普通肉汤，0.5 mL/只。三组感染鸡均采取滴鼻、点眼、腹腔注射。对注射以后的雏鸡隔离饲养，观察其发病及死亡情况，对死亡雏鸡立即剖检，观察病理学变化。无菌采取肝、脾组织，涂片、染色、镜检，并在麦康凯琼脂上划线分离，37 ℃培养24 h，观察菌落形态、大小。
2．3 综合诊断
根据发病情况、临诊症状、病理变化及实验室检查结果，作出诊断。
2．4 临床治疗
根据药敏试验结果，选用细菌高敏的药物治疗。同时，建议采取综合防制措施。
3 结果
3．1 流行病学调查
3．1．1发病情况15家农村养殖户的幼龄（13日龄～16日龄）肉杂鸡发病，每家饲养鸡2 900只～4 500只，死亡800只～2 500只，发病率为34.2%，病死率100%，雏鸡7日龄～12日龄开始发病。鸡群全部按正规程序免疫。发病后，曾用恩诺沙星、强力霉素加料治疗，同时，注射卡那霉素、庆大霉素、先锋霉素，但都无明显效果。
3．1．2临床症状主要表现精神不振，食欲废绝，羽毛松乱，倒卧；严重腹泻，粪便呈灰白色、水样；肛门周围被粪便黏着。
3.1．3病理变化肝肿大，出血，表面有大量坏死灶，周围呈大面积坏死；脾、肾肿大，出血，肾脏有尿酸盐沉积；嗉囊积食，有酸臭液体；十二指肠严重出血；心包有纤维素性渗出，心肌及心冠脂肪出血。
3．2 实验室诊断
3．2．1细菌的分离培养从病死鸡的心、肝、脾组织均分离到两种菌株，命名为A菌、B菌。在麦康凯琼脂平板上两种菌落形态为：A菌：较大，红色，圆形，边缘整齐，中央隆起；B菌：中等，无色透明，边缘整齐，中央隆起。在鲜血琼脂板上：A菌：无溶血；B菌：无溶血。
3．2．2形态结构及染色特性镜检A菌：革兰氏阴性，中等大小，两端略圆的短粗杆菌，呈单个存在，也有成双排列；镜检B菌：革兰氏阴性，较前者大，直杆菌。
3．2．3培养特性A菌在普通琼脂上生长为： 圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，灰白色半透明，直径2 mm～3 mm，中等大小的菌落；B菌在普通琼脂上为：圆形，表面光滑，边缘整齐，无色半透明，直径2 mm～3 mm，中等大小的菌落。SS琼脂上的生长情况为：A菌：圆形，中心混浊的紫红色菌落；B菌：圆形，透明的淡黄色菌落。伊红美蓝琼脂上的生长情况为：A菌：中等大小，圆形，带绿色金属光泽的紫黑色菌落；B菌： 较小，圆形，无光泽，浅黄绿色半透明菌落。营养肉汤中为：A菌：肉汤呈均匀混浊，管底有絮状沉淀，液面有菌环；B菌：肉汤呈均匀混浊，管底有絮状沉淀，液面无菌环。
3．2．4生化试验结果根据生理生化特性鉴定A菌为大肠杆菌，B菌为沙门氏菌（表1）。
表1两种细菌的生化反应结果
Table 1The results of Biochemical reaction of two bacteria
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项目 Content |
菌株(Strain) |
项目 Content |
菌株(Strain) | ||
|
A B |
A B | ||||
|
葡萄糖(Glucose) |
⊕ |
⊕ |
蔗糖(Sucrose) |
⊕ |
- |
|
乳糖(Lactose) |
⊕ |
- |
木糖(Xylose) |
⊕ |
+ |
|
甘露醇(Mannitol) |
⊕ |
⊕ |
硝酸盐还原(Nitrate reduction) |
+ |
+ |
|
水杨苷(Salicin) |
＃ |
- |
柠檬酸盐利用(Citrate use) |
- |
- |
|
山梨醇(Sorbitol) |
＃ |
+ |
M-R |
+ |
+ |
|
阿拉伯(Arabinose) |
⊕ |
⊕ |
V-P |
- |
- |
|
棉子糖(Raffinose) |
⊕ |
- |
吲哚(Indole) |
+ |
- |
|
鼠李糖(Rhamnose) |
+ |
+ |
明胶液化(Gelatin liguefaction) |
- |
- |
|
麦芽糖(Maltose) |
⊕ |
+ |
运动性(Movement) |
+ |
+ |
|
纤维二糖(Cellobiose) |
- |
- |
|||
注:①“+”表示阳性反应；②“—”表示阴性反应；③“⊕”表示阳性并产气；④“＃”表示阳性反应较弱。
Note:①“+”Showed positive reaction;②“—”Showed negative reaction;③“⊕”Showed positive reaction while producingair；④“＃”Showed weaker positive reaction.
3．2．5药敏试验结果大肠杆菌对庆大霉素、头孢三嗪、氟哌酸高敏，沙门氏菌和大肠杆菌都对沙拉沙星、氯霉素高敏；两种菌都对常用抗菌药青霉素、红霉素、利福平等不敏感（表2）。
表2药敏试验结果
Table 2The results of medicine sensitive experiments
|
药物名称 Drug name |
纸片含量 （µg/片） Content |
抑菌环直径（mm） 敏感度 Diameter of antibacterial circle Sensitivity 大肠杆菌 沙门氏菌 大肠杆菌 沙门氏菌 | |||
|
沙拉沙星(Sarafloxacin) |
0.1 |
36 |
35 |
++ |
++ |
|
复方磺胺(SXT) |
1.25/23.75 |
13 |
9 |
+ |
- |
|
氯霉素(CMP) |
30 |
23 |
19 |
++ |
++ |
|
头孢三嗪(CRO) |
30 |
25 |
14 |
++ |
+ |
|
氟哌酸(NOR) |
10 |
26 |
0 |
++ |
- |
|
庆大霉素(GEN) |
10 |
40 |
0 |
++ |
- |
|
链霉素(STR) |
10 |
12 |
0 |
+ |
- |
|
万古霉素(VAN) |
30 |
0 |
- |
- |
- |
|
头孢呋新(CFX) |
30 |
0 |
- |
- |
- |
|
青霉素(P-G) |
10IU |
0 |
0 |
- |
- |
|
红霉素(ERY) |
15 |
0 |
9 |
- |
- |
|
头孢他啶(CTD) |
30 |
0 |
- |
- |
- |
|
苯唑青霉素(OXA) |
1 |
0 |
- |
- |
- |
|
利福平(RIF) |
5 |
0 |
0 |
- |
- |
Note:①“++”the diameter of antibacterial circle above 15mm is high sensitive;②“+”10 mm≤d≤15 mm is medium sensitive;③“-” Show d＜10 is drug resistance.
3．2．6动物致病性试验结果
3.2.6.1菌落总数测定计算可得两种菌的普通肉汤含菌量为：大肠杆菌1.61×1010 cfu/mL，沙门氏菌1.5×1010 cfu/mL。3.2.6.2两种菌对本动物的回归试验三组感染雏鸡12 h开始发病并有死亡现象，感染大肠肝菌的雏鸡共死亡9只，感染沙门氏菌的雏鸡也死亡9只，混合感染的雏鸡11只全部死亡，对照组未出现发病及死亡。共同症状为食欲减退甚至废绝，低头沉郁，腹泻。剖检可见感染大肠肝菌的鸡只十二指肠出血严重，气管环、腹膜出血，肝、肺、肾、脾均有不同程度肿大、出血，腹腔有黄色渗出物；感染沙门氏菌的鸡只：心包有大量黄色积液，肝脏有针尖状出血和白色坏死灶，肺、肾出血，十二指肠严重出血；大肠杆菌、沙门氏菌混合感染的鸡只：以大量心包积液和腹腔积液为明显病变，腹腔为淡黄色纤维素性渗出物、恶臭。分别从病死鸡只的心、肝、脾组织接种麦康凯培养基，心包液、腹腔积液直接涂片镜检。培养所得细菌与镜检所见均为注射用感染菌。
3.2.6.32种菌对小白鼠的致病性小白鼠感染后12 h后开始死亡，症状和病变与感染鸡只类似。并从死亡小鼠的心、肝、脾组织分离到感染菌。
3．3 综合判定
根据发病情况、临诊症状、病理变化及实验室检查结果，确诊为鸡大肠杆菌和沙门氏菌的混合感染。
4 讨论
4．1 疫病诊断
本次疫病呈地方性流行，发病集中于7日龄～12日龄雏鸡，发病率、病死率都很高，致病性很强。以严重水样腹泻，粪便呈灰白色，心包、腹腔大量纤维素性渗出，十二指肠严重出血为特征症状和病理变化。细菌分离，得到两种细菌，根据菌体形态观察、染色特性、生化试验、运动性检查、鉴别培养基特性等试验，鉴定两种细菌为大肠杆菌和沙门氏菌。动物致病性试验表明，两种菌均具有很强的致病性，综合诊断结果为大肠杆菌和沙门氏菌的混合感染。
4．2 发病原因
（1）饲养环境条件差，场地污染严重。多数农民养鸡未经过系统专业培训，没有认识到兽医卫生工作的重要性。（2）防疫措施不健全，疫苗使用不当。不定期消毒，对有传染病的鸡不及时隔离治疗；病、健鸡混养。
（3）滥用药物。为了尽快看到疗效，大剂量滥用药物或频繁换药，使细菌产生耐药性；或未经巩固治疗即停药，使病复发。
4．3 耐药性及治疗
大肠杆菌的治疗可通过常规药物来进行，其中以氟喹诺酮类药物效果为佳。目前主要应用于临床治疗的有诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星等，但不宜长期使用。因其可造成肠道菌群失调，影响饲料利用率，降低增重率并可导致一系列肠道反应[8]。同时，大肠杆菌和沙门氏菌都易产生对抗生素的耐受性，而且多重耐药现象严重。因此，对细菌性疾病的治疗，采用药敏试验选择合适药物是一个很好的办法。
沙拉沙星是第一个被美国食品药物管理局（FDA）批准用于食品动物的氟喹诺酮类药物。沙拉沙星抗菌谱广，对大多数革兰氏阴性菌、阳性菌、支原体及某些耐药菌株有很好的抗菌活性[9]。细菌对沙拉沙星单步自发耐药频率低，但诱导耐药性MIC值显示，细菌多次接触该药后，也会产耐药性[10]。所以。在使用药物治疗时，应注意几种药物的适当配伍或交替使用，有利于延缓耐药菌株的产生，从而取得良好疗效。 （张淑霞，杨增岐，陈 萍，何 来 西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨陵712100) ）
