摘要： 为了从分子水平上确定奶牛附红细胞体（E. wenyoni）的分类学地位及建立奶牛附红细胞体感染诊断方法。本研究通过利用原核生物16S rRNA基因通用引物，对分离得到的奶牛附红细胞体(广西株，E. wenyoni-GX)进行16S rRNA基因的克隆及测序，并建立系统发育进化树；同时根据测序结果设计诊断引物，建立奶牛附红细胞体感染的PCR诊断方法。结果扩增出长约1.5 kbp的奶牛附红细胞体的16S rRNA基因片段；特异性试验和敏感性试验表明，所建立的PCR方法与常见支体、细菌及原虫无交叉反应，能检测奶牛附红细胞体最低DNA量为0.145 fg。通过试验结果分析，建议将奶牛附红细胞体这类血营养菌划归入支原体科、支原体属；同时，所建立的PCR诊断方法是特异、敏感、快速的，可应用于临床检测。
关键词： 附红细胞体； 16S rRNA基因； PCR； 克隆； 系统发育进化树
附红细胞体(Eperythrozoon,EH)寄生于人和动物红细胞表面、血浆及骨髓中，为多形态、无细胞壁、无明显细胞核和细胞器的原核生物。最早于1928年由Schilling在啮齿动物中发现,随后在猪、马、羊、牛、鸡、犬、猫、骆驼等多种动物及人体中也相继发现了附红细胞体。由于附红细胞体既有原虫的特点，又有立克次氏体和支原体的特点，所以在分类上意见不统一。
近几年来，随着人畜附红细胞体病的不断增多,本病逐渐引起了医学和畜牧兽医工作者的注意,在我国猪、犬等家畜中已有暴发流行的趋势，尤其猪、奶牛附红细胞体病已给我国畜牧业带来了较为严重的经济损失。因此，在分子水平上探索该类微生物的分类学地位；开发简易、敏感、特异的诊断技术是当前研究附红细胞体病的首要任务。为附红细胞体病的病原学研究及疾病防治提供可靠的依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 Tap聚合酶、dNTP、Trizol、氨苄青霉素（Amp）、氯仿、苯酚购于上海生工生物工程技术服务有限公司；胶回收试剂盒购于上海华舜生物工程有限公司。E.coli DH5α由本实验室保存，pMD18-T克隆载体购于大连宝生物工程有限公司。
1.2 16S rRNA基因的克隆及测序
1.2.1 病原纯化及基因组抽提 参照Hall等报道的方法对抗凝血样分离纯化E.wenyoni。纯化后的E.wenyoni加1 ml的PBS，取其中的0.2 ml用于基因组DNA的抽提，用Trizol法进行基因组DNA抽提。
1.2.2 引物 原核生物16S rRNA基因通用引物为，P1:5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′；P2:5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.3 PCR扩增 反应在50 μl体系中进行：10x buffer 5.0 μl，MgCl2 2.0 μl，dNTP 1.0 μl，引物各1.0 μl，模板1.0 μl，Taq DNA Polymeras 0.5 μl，ddH2O 38.5 μl。PCR循环参数：94℃预变性5 min；然后94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1.5 min，循环扩增35次；最后72℃延伸10 min，于4℃结束反应。
1.2.4 克隆与鉴定 利用T-A连接，按pMD18-T载体说明书将纯化的PCR产物直接连接于pMD18-T载体中，按常规方法转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑选白斑，接于含有Amp的LB培养基过夜培养。取1.5 ml培养物用于质粒抽提，然后进行酶切（EcoRⅠ和HindⅢ）和PCR鉴定。
1.2.5 测序及系统进化树的建立 挑选阳性克隆送大连宝生物工程有限公司进行DNA双向测序。同时利用DNAMAN分析软件将测序所得的E.wenyoni-GX 16S rRNA基因核苷酸序列与GenBank上收录的绵羊附红细胞体(E.ovis)、牛的温氏附红细胞体(E.wenyoni)、猪附红细胞体(E.suis)、鼠血巴尔通氏体(H.muris)、猫血巴尔通氏体(H.felis)、狗血巴尔通氏体(H.canis)及支原体、立克次氏体及肠杆菌科细菌代表株的16S rRNA基因核苷酸序列进行同源性比对和系统进化树的建立。
1.3 PCR诊断方法的建立
1.3.1 病原来源 血样来源于广西某奶牛场,肝素为抗凝剂。牛双芽巴贝斯虫DNA样由法国南特国家兽医学院惠赠，猪肺炎支原体和鸡毒支原体DNA样由广西壮族自治区兽医研究所惠赠，大肠杆菌、肠道沙门氏菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫由本实验室保存。
1.3.2 引物设计与合成 根据测序所得的奶牛附红细胞体16S rRNA基因序列（GenBank上的登录号为AY769937），设计E.wenyoni的种特异性引物Cm1和Cm2，预计扩增片段为415 bp。由上海生工生物工程技术有限公司合成,引物序列为：
Cm1：5′-CGAACGAGTGGAACTTGTTCTGC-3′；Cm2：5′-TAGTACCATCAAGGCGTGCTC-3′。
1.3.3 DNA抽提 取200 μl抗凝血，用Trizol法进行基因组DNA抽提。
1.3.4 PCR扩增体系及循环参数 反应在25 μl体系中进行：10x buffer 2.5 μl，MgCl2 1.0 μl，dNTP 0.5 μl，引物各0.5 μl，模板1.0 μl，Taq DNA Polymeras 0.25 μl，ddH2O 18.75 μl。循环参数：94℃预变性2 min；然后94℃ 20 s，59℃ 20 s，72℃ 20 s，循环扩增32次；最后72℃延伸1 min，于4℃结束反应。
1.3.5 最佳退火温度的选择以E.wenyoni阳性血样DNA为模板，退火温度范围在（55℃、55.4℃、56.1℃、57.2℃、58.6℃、59.8℃、60.5℃、61℃）之间进行梯度PCR。
1.3.6 PCR产物的回收与测序 利用胶回收试剂盒回收PCR产物，送大连宝生物工程有限公司测序。
1.3.7 特异性试验以E.wenyoni DNA为阳性模板，以猪肺炎支原体、鸡毒支原体、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫DNA为对照模板，按最佳退火温度进行PCR反应，电泳分析其PCR产物。同时，在以上病原体的16S rRNA基因保守区设计引物，对以上病原DNA进行了PCR扩增。
1.3.8 敏感性试验 经紫外分光光度仪测E.wenyoni DNA的浓度，然后以100为梯度对其进行连续稀释成8个不同浓度，按上述最佳条件进行PCR扩增，确定所建立的PCR方法能检测的奶牛附红细胞体最低DNA量。
1.3.9 临床血样的检测 用所建立的PCR方法分别对场A（20份血样）和场B（10份血样）的30份血样进行检测；同时对在4℃存放长达3个月的血样进行检测。
2 结果
2.1 16S rRNA基因的克隆及测序
2.1.1 PCR扩增结果 以分离纯化的E.wenyoni基因组为模板，P1和P2为引物，扩增出一条约为1.5 kb的目的片段，电泳图如图1。
2.1.2 PCR产物的克隆与鉴定 PCR纯化产物与pMD18-T载体连接、转化，扩增培养后进行质粒抽提，以所得质粒DNA为模板，进行PCR和酶切鉴定。目的片段内有EcoRⅠ酶切位点，被切为两段，结果分别为图2和图3。
图1 PCR扩增结果（略）
图2 PCR鉴定结果（略）
图3 酶切鉴定结果（略）
2.1.3 测序结果 挑选阳性克隆经DNA双向测序，结果得到一条长度为1 399 bp(已去除引物序列)的近乎全长的16S rRNA基因片段，通过同源性分析，其核苷酸序列与Neimark等报道的E.wenyoni 16S rRNA基因片段核苷酸序列同源性高达97.1%。所得序列已登录到GenBank上，登录号为AY769937。
2.1.4 系统进化分析结果 用DNAMAN分析软件将奶牛附红细胞体（E.wenyoni和E.wenyon
I GX）16S rRNA基因序列与E.ovis、E.wenyoni、E.suis、H.muris、H.felis、H.canis及支原体、立克次氏体和肠杆菌科细菌代表种的16S rRNA基因核苷酸序列进行比对分析，构建树形进化图（图4）。
2.2 PCR诊断方法的建立结果
图4 测序结果与E.ovis、E.wenyoni、E.suis、H.muris、H.felis、H.canis及支原体、立克次氏体和肠杆菌科细菌代表种同源关系进化树（略）
2.2.1 PCR扩增结果 将E.wenyoniPCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，其扩增产物与预计大小一致。
2.2.2 测序结果 将回收纯化PCR产物直接送大连宝生物工程有限公司进行测序，结果其长度为415 bp，与E.wenyoni-GX的16S rRNA基因相应序列的同源性为98.2%。
2.2.3 梯度PCR结果 以E.wenyoni阳性血样DNA为模板，退火温度范围在（55℃、55.4℃、56.1℃、57.2℃、58.6℃、59.8℃、60.5℃、61℃）之间进行梯度PCR扩增，通过电泳发现当退火温度在59.8℃时，其PCR产物条带最好。结果见图5。
图5 梯度PCR结果（略）
2.2.4 特异性试验结果 电泳结果显示仅E.wenyoni阳性孔出现预期条带，而作为对照样本的猪肺炎支原体、鸡毒支原体、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫DNA均无此条带出现（图6）。而保守引物对以上病原体DNA进行PCR，均出现了预期大小约为280 bp的条带（图7）。因此，所建立的PCR方法具有很好的特异性。
图6 特异性试验结果（略）1～9依次为空白对照、猪肺炎支原体、鸡毒支原体、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫和阳性对照，M为DL 2 000 Marker
图7 利用保守引物进行PCR的结果（略）
1～8依次为猪肺炎支原体、鸡毒支原体、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫和阳性对照，M为DL 2 000 Marker
2.2.5 敏感性试验结果 从E.wenyoni阳性血样DNA的9个浓度的PCR结果来看（图8），以孔5为检测的最低界限，则该诊断方法可检测得到E.wenyoni的最低DNA浓度为0.154 fg。
图8 敏感性试验结果（略）
1的DNA浓度为1.54 mg/ml，1～10分别为以100为梯度进行连续稀释，M为DL 2 000 Marker
2.2.6 临床检测结果 对场A的20份血样重复检测3次，结果均一致（12份为阳性，8份为阴性），阳性率为60%；对场B的10份血样进行1次检测，结果是8份为阳性，2份为阴性，阳性率为80%。同时，在4℃存放长达3个月的血样一样可以检出。
3 讨论
3.1 对未知的而又不能人工培养或培养条件极为苛刻的病原体，通过扩增其16S rRNA基因或其他有意义的基因，以揭示其分子特征，进行病原的分子鉴定，是一种有效的病原鉴定方法。本试验就是基于这种方法，扩增出了一条长度为1 439 bp的16S rRNA基因片段，并对其进行的克隆、测序，通过核苷酸序列同源性的比较，与国外已发表的牛温氏附红细胞体(E.wenyoni)的16S rRNA基因片段核苷酸序列同源性高达97.1%，因此从分子水平上证实了试验血液中确实存在牛温氏附红细胞体这一病原；但由于两者的核苷酸序列相差2.9%，因此本试验分离得到的牛温氏附红细胞体与国外发表的牛温氏附红细胞体的基因型存在一定的差异，这对该病的分子流行病学分析具有一定的意义。本试验通过与GenBank中收录的其他动物附红细胞体、血巴通氏体及支原体和立克次氏体目的代表种的16S rRNA基因进行系统进化分析，表明这类血营养菌与柔膜体纲，支原体科，支原体属的成员最接近，与Rikihisa等(1997)，Neimark（1997）,Messick（1998）的研究结果一致。
3.2 用本文所建立的PCR方法进行临床检测时，发现对全血的检出率优于血浆的检出率，而血浆的检出率又优于血清的检出率，这可能是当附红细胞体从脊髓转移到血液的初期，附红细胞体绝大多数是附着于红细胞上，只有当其血液内大量增殖后才游离于血浆中。因此对附红细胞体感染进行早期诊断时，最好选择全血作为被检材料。
3.3 通过活体压片和涂片染色研究发现，同一份血样在不同时间将会得到不同的结果，附红细胞体阴性血液在活体压片时，随着时间的推移，其红细胞将逐渐发生变形，并且其形状很难与阳性的相区分开；同时，一份阳性的血样在活体压片时，随着时间的推移，其红细胞形状将逐渐变圆，最终很难与阴性红细胞相区分。并且对实验奶牛(阳性)进行跟踪镜检时发现，在完全相同的条件下，某段时间一直为阳性，而某段时间又一直为阴性，但PCR方法检测均为阳性，研究其他动物附红细胞体的人员同样也出现类似的现象。因此，镜检作为该病的诊断受到严格的时间限制，只有在采血后立刻进行才具有一定的可靠性，但能否检出还与被检动物当时的免疫状态有很大关系。而该PCR诊断方法不仅在感染早期就可以快速、准确的检测出病原，同时为病原的深入研究，疾病的流行病学调查和防治打下基础，也为药物的疗效评价提供了可靠的依据。
