伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV）属于疱疹病毒科、疱疹病毒亚科，又称猪疱疹病毒Ⅰ型。某些疱疹病毒，如牛疱疹病毒、马流产病毒、猫鼻气管炎病毒及鸡传染性喉气管炎病毒等都具有凝集动物红细胞的特性。据国外资料报道，PRV也能凝集小鼠红细胞，而目前国内这方面的报道甚少，仅有李学伍等做过此方面的试验研究，本人在李学伍等人试验方法的基础上进行了改进，应用鞣酸法处理小鼠红细胞，提高了实验的敏感性和可重复性，效果十分理想。在猪易感病毒中有很多病毒都能凝集小鼠红细胞，如猪细小病毒，乙型脑炎病毒，冠状病毒等。为了检测伪狂犬病病毒是否能凝集小鼠红细胞及其血凝性可否被特异性抗血清抑制，从而建立一种快速诊断伪狂犬病的方法，特作本试验。
1 材料、试剂与配制方法
1.1 细胞及培养
PK-15细胞：购自中国兽医药品监察所。培养基RPMI1640，美国GIBCO公司生产，批号：20030128。Vero细胞：河南农业大学牛业研究所保存。生长液：含10%超级新生牛血清的RPMI-1640培养液，pH值7.2～7.4。维持液：含５%超级新生牛血清的RPMI-1640培养液，pＨ值7.2～7.4。
1．2 毒株及抗原
PRV闽Ａ株：购自中国兽医药品监察所。
抗原制备：将PK-15细胞、Vero细胞分别于３７℃、５% CO2恒温培养箱培养，细胞长成单层后，弃去生长液，然后接种PRV，病毒量以每瓶2 ml为宜，吸附60 min后，加维持液继续培养，待80%以上的细胞出现病变后收毒。收毒时反复冻融３次，所得病毒液以3 000 r/min离心30 min后，弃沉淀，取上清，-20℃保存备用。
1.3标准阳性血清购自华中农业大学。
1.4试剂及配制
(1)牛血清白蛋白：华美生物工程公司生产，批号20011128,电泳纯。柠檬酸三钠：广东汕头西陇化工厂生产，分析纯，批号990208。明胶：上海化学试剂站分装厂，批号940702，化学纯。鞣酸：上海化学试剂厂，批号20010205，化学纯。丙酮酸钠：郑州化学试剂二厂，分析纯，批号030120。青霉素：华北制药股份有限公司，批号0206308。链霉素：华北制药股份有限公司，批号0206308。
(2)缓冲液（pＨ7.2）：由0.980 g磷酸氢二钠，0.197 g磷酸二氢钠，1.306 ｇ氯化钠加蒸馏水至200 ml配制而成，然后再加入0.02 g明胶，以113℃高压灭菌30 min。用时每100ml加入0.02 g牛血清白蛋白，４℃保存。
(3)抗凝剂：氯化钠0.9 ｇ，柠檬酸钠3.8 ｇ，加蒸馏水定容至100 ml。
1.5材料
９６孔V型板由南京塑料三厂生产；透析袋:由SERVA公司生产，微孔直径2.4 nm;移液枪，50μl枪头，移液管若干，眼科剪，镊子等。
1.6实验动物和红细胞的制备
(1)成年Balb/c小鼠:购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
(2)普通小鼠:购于本校牧医工程学院动物房。
(3)红细胞的制备：用眼科剪剪去小鼠眼球，暴露眼底血管，采血数滴于加有抗凝剂的离心管中，用PBS洗涤３次，然后用PBS配成１０％红细胞，与1/40 000浓度鞣酸溶液等体积均匀混合，于３７℃作用１ ｈ后离心，再用PBS洗涤３次，以1 500 r/min离心，每次５ min，使用时加PBS配成0.5％红细胞悬液。
２试验
2.1 ＨＡ
９６孔V型板从1～12孔，每孔加入PBS 50 μl,然后第1孔加入50 μl PRV液，用微量加样枪作倍比稀释至第11孔，即PRV从1∶2至１∶2 048稀释。第12孔不加PRV液，作为对照，然后每孔各加入浓度为0.5％红细胞50 μl，在振荡器上混合均匀，于37℃恒温箱中作用，于90 min后观察结果， 以完全凝集红细胞的最大病毒稀释倍数为一个血凝单位。
2.2HI
96孔V型板中每孔加入PBS 50 μl,然后在第1孔内加入50 μl标准阳性血清，并倍比稀释至第11孔（第12孔作抗原对照），然后各孔分别加入50 μl 14个单位的PRV（第11孔除外，做血清对照），混合均匀后于３７℃作用30 min,然后每孔再分别加人0.5%红细胞悬液50 μl，混合均匀后37℃恒温箱作用，于90 min后观察结果。
3 结果分析
3.1 HA试验结果
用PK-15细胞、 Vero细胞增殖PRV， 分别在4℃， 27℃， 37℃进行HA试验， 结果见表1。
表1 HA试验结果（略）
从表中可以看出PRV具有凝集小鼠红细胞的特性，经PK15细胞、Vero细胞培养后，其红细胞的凝集效价基本无差异，而Balb/c小鼠的红细胞凝集效价明显高于普通小鼠的红细胞的凝集效价，且在4～37℃范围内温度变化对试验结果影响很小。
3.2HI试验结果
用PRV阳性血清进行血凝抑制试验，结果表明PRV凝集小鼠红细胞的特性能被PRV阳性血清特异性抑制，且高免血清的血凝抑制效价达到1∶256。该试验证明了伪狂犬病病毒血凝抑制试验的特异性。
4 讨论
4.1 试验结果表明，伪狂犬病病毒能够凝集小鼠红细胞。据资抖报道，Balb/c小鼠红细胞的凝集效价高于普通小鼠，且在4～37℃范围内温度对血凝影向不明显，本试验也证实了这一点。伪狂犬病病毒的血凝性能被伪狂犬病病毒的高免血清特异性抑制，这证明了抗伪狂犬病病毒血清血凝抑制试验的持异性和可靠性。在临床诊断中，HA、HI试验与中和试验相比，具有快速、简便、易于操作等特点。
4.2在血凝试验中存在许多影响因素。据报道，小鼠红细胞表面的凝集素受体可被胰蛋白酶灭活， 试验证明用胰蛋白酶及福尔马林分别处理红细胞后， 应用胰酶处理伪狂犬病病毒， 其血凝价下降。 经福尔马林处理的伪狂犬病病毒血凝价稍有下降， 说明福尔马林对伪狂犬病病毒表面的凝集素具有一定的灭活作用， 但其灭活能力没有胰酶强， 灭活的程度可能与作用的时间有一定的关系。 据文献报道， α-淀粉酶、胃蛋白酶、高碘酸钾、EDTA等试剂都能使伪狂犬病病毒表面的凝集素失活， 因此， 在进行血凝试验过程中， 要避免上述试剂的污染。 近年来的试验证明， PRV抗原表面的凝集素为PRV的gⅢ糖蛋白，编码PRV糖蛋白的９Ⅲ基因缺失株，则不具有血凝特性。 影响血凝试验的因素还很多，主要是导致红细胞受体或病毒表面血凝素失活的化学试剂和酶。 在伪狂犬病病毒的血凝试验中应充分考虑到这些因素的影响， 以免影响试验结果的准确性。
4.3本文证实了伪狂犬病病毒的血凝和血凝抑制试验是一种快速、操作简单、易于推广的诊断方法，可以用于伪狂犬病的诊断和血清学调查。