猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素、外膜脂蛋白的表达及重组蛋白的纯化

摘　要：将构建保存的重组表达质粒pET­ApxⅠA、pET­ApxⅢA和pPRoAppOML­1用IPTG诱导表达，选择最佳的表达条件为IPTG1.0 mmol/L，温度为37 ℃，表达时间为8 h，表达产物用SDS­PAGE鉴定，分别表达41、41、45ku的蛋白，与预期蛋白大小一致。将表达产物用试剂盒进行纯化，得到较好的目的条带，并对其进行Westernblot检测，经过分析，pET­ApxⅠA、pET­ApxⅢA表达产物具有较好的免疫反应性。

关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌；表达；纯化；免疫反应性

猪传染性胸膜肺炎是一种高度接触传染致死性呼吸道传染病。急性和亚急性病例以纤维素性出血性胸膜肺炎，慢性病例以纤维素性坏死性胸膜肺炎为主要特征^[1]。近年来随着养猪业规模化、集约化的发展，本病的发生呈暴发趋势，对养猪业的危害日益严重。

本病病原为胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropeumoniae，App)。其毒力因子为主要的免疫原。App有很多毒力因子可以引起猪致病，包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白(Outermemberanc protein，Omp)、转铁结合蛋白、蛋白酶、渗透因子及溶血素等^[2]。有人对上述毒力因子及其免疫原性进行分析，发现溶血毒素、外膜蛋白在胸膜肺炎发生过程中扮演着更为重要的角色，也是主要的免疫原性物质^[3­6]。

在App的15个血清型中共发现了4种不同的Apx溶血素，即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。ApxⅠ具有很强的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞和中性粒细胞也具有很强的细胞毒性作用。而ApxⅢ与ApxⅠ和ApxⅡ的差异较大^[4]，它对热稳定，具有很强的细胞毒性，但却没有溶血活性。研究表明，ApxⅢ对猪肺泡巨噬细胞和中性粒细胞有很强的杀伤力，可严重破坏猪肺部非特异性细胞防御体系。它们都是胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子，也是重要的保护性抗原^[5]。Omp是胸膜肺炎放线杆菌的另一个重要毒力因子，针对Omp的抗体具有调理活性，所以Omp也是App的一种重要保护性抗原^[6]。由此对毒素pET­ ApxⅠA、pET­ApxⅢA、pPRoAppOML­1进行了表达及重组蛋白的纯化。

1　材料与方法

1.1　菌株及质粒

重组表达质粒pET­ApxⅠA、pET­ApxⅢA和pPRoAppOML­1由本实验室构建并保存。

1.2　主要试剂

异丙基­β­D­硫代半乳糖苷(IPTG)、盐酸胍(guanidinehydrochloride)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇(PEG1500)、二硫苏糖醇(DTT)、甘氨酸(Glycine)、尿素等购自BBI公司；低分子质量标准蛋白购自Promega公司；丙烯酰胺溶液(29∶1)储存液、Trion­X100、Tween­20、过硫酸铵(APS)、四甲基二乙胺(TEMED)、硝酸纤维素膜(NC膜)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、月桂肌氨酸、20×PBS浓缩液、氨基黑等购自上海生工生物工程技术服务有限公司；猪传染性胸膜肺炎阳性血清由本实验室制备；辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG(HRP­IgG)购自Gibco公司；二氨基联苯胺(DAB)、牛血清白蛋白(BSA)、氯化钴购自Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.3　重组菌的诱导表达

将本实验室保存的重组质粒pET­ApxⅠA、pET­ApxⅢA转入大肠埃希菌JM109(DE3)，然后将其涂布于含有卡那霉素(100μg/mL)的LB培养基上，37 ℃培养18 h后可挑取单菌落划线培养，再接入5 mL LB培养基中，于37 ℃以220r/min摇菌培养6 h～8 h后，用0.5 mmol/L～1.0 mmol/L IPTG诱导表达，在同样条件下继续培养约8 h。

同时将本实验室保存的pPRoAppOml­1转入大肠埃希菌JM109(DE3)，然后将其涂布于含有氨卞霉素(100μg/mL)的LB培养基上，37 ℃培养18 h后可挑取单菌落划线培养，再接入5 mL LB培养基中，于37 ℃以220r/min摇菌培养6 h～8 h后，用0.5 mmol/L～1.0 mmol/L IPTG诱导表达，在同样条件下继续培养约8 h。

1.4　表达产物的SDS­PAGE鉴定

按照分子克隆书中所介绍的方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS­PAGE)，以鉴定表达产物的相对分子质量和表达量，同时用仅转入空载体的全菌菌体蛋白液作为阴性对照。

1.5　重组蛋白的提纯及复性

1.5.1　包涵体的纯化

将诱导表达的重组菌收集、离心、洗涤后，重悬于PBS中进行超声破碎，从细胞裂解物中提取包涵体，裂解包涵体并进行重组蛋白的纯化和复性。

1.5.1.1　包涵体的提取和初纯

①收集诱导表达的重组菌全菌液，于4 ℃以7 500 r/min离心10 min，弃上清；②分别用去离子水和冰冷的1×PBS(pH7.4)洗涤菌体沉淀各一次，每次于4 ℃以7 500 r/min离心10 min，弃上清；③按5 mL PBS/100mL原菌液量重悬菌体沉淀，4 ℃作用30 min后置于冰上进行超声波破碎(250 W，脉冲5 s，间隔5 s，作用温度4 ℃，处理10min～15 min。处理应以不产生泡沫、尖锐刺耳声和菌液成半透明为度)，置－20℃冻存数小时，再次进行超声波破碎(同上述条件)；④超声破碎2次后，于4 ℃以7 500 r/min离心10min，弃上清，所得沉淀即为包涵体；⑤用细胞裂解液Ⅱ洗涤所得包涵体2次～3次，去离子水洗涤1次～2次，置于－20 ℃备用。

1.5.1.2　包涵体的纯化　由于包涵体的纯化使用镍柱亲和层析(柱料为Ni­NTA His·BindResins)，所以选用了pET­28a表达载体，以便在镍柱纯化时利用组氨酸标签的作用纯化出所需要的蛋白。采用镍亲和层析试剂盒变性条件下的纯化包涵体方法，按照试剂盒说明书的步骤和方法进行柱料的再生。

1.5.1.3　包涵体纯化物的复性　按蛋白复性试剂盒说明书操作，进行复性。

1.6　表达产物的Western blot分析

以标准蛋白分子质量为参照，进行标准蛋白分子质量、pET­APXⅠA、pET­APXⅢA、pPRocAppOml­1表达产物的SDS­PAGE电泳。电泳结束后进行Westernblot分析。

2　结果

2.1　重组蛋白的鉴定

2.1.1　SDS­PAGE鉴定　重组表达菌经IPTG诱导表达后分别产生约41、41、45ku大小的表达条带，与预期蛋白大小基本相符，而pET­28a空载体转化对照菌的诱导表达产物无此表达带，初步表明重组表达菌表达产物为目的重组蛋白(图1，图2)。

2.1.2　包涵体纯化物的鉴定

结果见图3。

1.IPTG诱导的pET­28a产物；2～6. IPTG诱导的分别在2、4、6、8、10 h pET­ApxⅠA的产物；7～11.IPTG诱导的分别在2、4、6、8、10 h pPRoAppOml­1的产物；M1，M2.蛋白分子质量标准

1.pET­28a products induced with IPTG；2­6.pET­ApxⅠA productsinducedin 2,4,6,8,10 h with IPTG；7­11.pPRoAppOml­1 products inducedin 2,4,6,8,10 hwith IPTG；M1，M2.Protein Marker

图1　pET­ ApxⅠA和PPRoAppOml­1重组菌表达产物的SDS­PAGE

Fig.1　SDS­PAGE of expression products ofpET­ApxⅠand pPRoAppOml­1

1.IPTG诱导的pET28a产物；2～5. IPTG诱导的pET­ApxⅢA分别在2、4、6、8、10h的产物；M.蛋白分子质量标准　

1.pET­28a products induced with IPTG；2­5.pET­ApxⅠA products inducedin 2,4,6,8,10 h with IPTG；M.Protein Marker

图2　pET­ ApxⅢA重组菌表达产物的SDS­PAGE

Fig 2　SDS­PAGE of expression products of pET­ ApxⅢA

1、4、6.分别为IPTG诱导的pET­APXⅠA、pPRoAppOml­1、pET­APXⅢA产物；M.蛋白分子质量标准；2、5、7.分别为pET­APXⅠA、pPRoAppOml­1、pET­APXⅢA纯化后产物

1,4,6.pET­APXⅠA，pPRoAppOml­1 and pET­APXⅢA products induced withIPTG；M.Protein Marker；2,5,7.Purified pET­APXⅠA，pPRoAppOML­1 andpET­APXⅢA expression products

图3　纯化的重组菌表达产物的SDS­PAGE

Fig.3　SDS­PAGE of purified expression products of therecombinantbacteria

从图3可以看出，在纯化之后，杂带明显减少，包涵体的纯度得到了显著的提高。

2.1.3　Westernblot分析　结果显示(图4)，重组菌表达产物中的蛋白条带可被猪传染性胸膜肺炎阳性血清识别。证明已获得重组蛋白的准确表达。

M.蛋白分子质量标准；1～3.分别为IPTG诱导的pET­ ApxⅠA、pPRoAppOml­1、pET­ APXⅢA产物

M. Protein Maker；1­3.pET­APXⅠA，pPRoAppOml­1 and pET­ APXⅢAexpressionproducts with IPTG

图4　表达产物的Western blot分析

Fig.4　Western blot analysis of the expression products

3　讨论

3.1　App是一种多毒力因子的条件致病菌，其致病因子及其致病机理非常复杂。我们对其相关毒素基因构建好的重组质粒进行了表达，对其表达条件进行了摸索，经过试验对诱导剂的浓度和表达温度进行了选择，最终确定了最佳的表达条件，

IPTG诱导最适终浓度为1.0 mmol/L，诱导最适温度选择为37 ℃，诱导时间最佳为8h。这为以后的纯化作了很好的铺垫，是蛋白纯化得以顺利进行。

3.2　本试验所表达的产物为包涵体形式，包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一步是对培养收集的细胞进行破碎。收集到的包涵体沉淀需用去污剂(TritonX­100或脱氧胆酸钠)和低浓度变性剂(2 mol/L尿素或盐酸胍等)洗涤除去脂类和膜蛋白^[7]，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解。所以试验采用的是反复冻融细胞并结合超声波处理来裂解细胞，由于超声处理过程容易产生热量集中，造成蛋白碳化，选择在冰上超声，并采用一定的时间间隔，延长超声处理时间使包涵体蛋白彻底释放，沉淀下来，与可溶性蛋白分离，从而获得包涵体。经过纯化，得到比较理想的产物条带，但是，其量比较小，所以在以后的工作中还需要进一步的摸索条件。

3.3　纯化产物经过Westernblot分析均有较好的免疫反应性，这些工作和结果为进一步研究新型亚单位疫苗和诊断试剂奠定了良好的基础。