4株不同亚型流感病毒NP基因的原核表达

摘　要：为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用，采用RT­PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因，分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上，在大肠埃希菌中进行诱导表达。SDS­PAGE和Westernblot检测结果表明，H1N1亚型流感病毒NP蛋白得到表达，并且能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应，具有良好的反应活性；而H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的重组NP蛋白未获得表达。本研究结果表明，不同毒株的NP蛋白在大肠埃希菌中的表达具有一定差异性，为把NP蛋白作为诊断抗原的开发、ELISA诊断方法的建立以及蛋白功能的研究奠定了基础。

关键词：流感病毒；NP基因；原核表达

流感是由流感病毒引起的一种烈性传染病，对人类与畜禽危害严重，已经发生过4次世界性流感的大流行。流感的流行不仅会给养殖业带来毁灭性打击，对国民经济乃至整个世界经济都会产生重大影响，而且严重危害人类健康。流感病毒变异极为频繁，常造成免疫失败，给防控带来困难，因此，早期快速诊断和血清学监测对防控流感有极其重要的意义。

尽管流感病毒极易发生变异，但主要集中在血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)上。NP蛋白却高度保守^[1]，Shu L L等^[2]对从1933年－1990年间分离的人流感病毒NP基因演化变异情况进行研究发现，NP基因变异率为每年2.3×10^－3，其中只有32%的碱基突变导致了氨基酸变化，其余均为无意义突变(silentmutations)。由于NP蛋白的这一特点，使其成为流感病毒诊断用抗原的理想靶蛋白^[3]。而且NP蛋白具有种群和型特异性，以重组NP蛋白为诊断抗原建立起来的琼脂扩散试验(AGIP)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，具有快速、成本低、操作简单、特异性好、安全性高、结果容易判定等优点^[4]。

本研究对A/Swine/Guangdong/LM2/05(H1N1)、A/Swine/Henan/BXL/04(H3N2)、A/Chicken/Guangdong/W2/04(H5N1)、A/Duck/Guangdong/DP/04(H9N2)4个毒株的NP蛋白进行克隆，成功构建了原核表达载体，重组质粒在大肠埃希菌中进行诱导表达。

1　材料与方法

1.1　病毒和血清

猪流感病毒A/Swine/Guangdong/LM2/05(H1N1)株简称LM2株，A/Swine/Henan/BXL/04(H3N2)株简称BXL株，禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/W2/04(H5N1)株简称W2株，A/Duck/Guangdong/DP/04(H9N2)株简称DP株；LM2株和W2株攻毒的鼠高免血清，HI抗体效价分别为1∶128和1∶256，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存。

1.2　载体和菌种

pET30(a)原核表达载体、TOP10、DE3大肠埃希菌感受态细胞由本实验室保存。

1.3　主要试剂

病毒RNA提取试剂Trizol、cDNA反转录试剂禽源反转录酶AMV购自Invitrogen公司；PCR扩增用的Ex TaqDNA聚合酶，末端平滑化所用的T4 DNA聚合酶，以及用于连接反应的T4DNA连接酶，限制性内切酶EcoRⅤ、HindⅢ、BsmBⅠ、NotⅠ、NdeⅠ购自宝生物工程(大连)有限公司；IPTG、卡那霉素购自上海生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自深圳晶美公司；质粒(小量)抽提试剂盒、胶回收(小量)试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；DAB显色试剂盒购自博士德生物工程有限公司；带有组氨酸标签的蛋白纯化试剂盒购自Novagen公司；BCA法蛋白定量试剂盒购自北京百泰克公司。

1.4　NP基因的RT­PCR扩增与克隆

1.4.1　引物设计　根据GenBank中的已知NP基因序列设计4对NP基因RT­PCR扩增引物，其中上游引物分别从4个毒株NP基因开放阅读框的第8个氨基酸开始；并参照已知序列设计一条禽流感反转录通用引物，具体引物序列见表1。

表1　4个毒株NP基因组扩增用引物

Table 1　The primers of RT­PCR for NP gene of four strains

1.4.2　病毒RNA的提取及目的基因的RT­PCR扩增　按TRIzol试剂说明书分别从含有H1N1、H3N2、H5N1和H9N2亚型流感病毒的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA。以Uni12为引物，采用禽源反转录酶AMV，按试剂盒说明书进行反转录合成各自cDNA。以cDNA为模板分别对四个毒株的NP基因进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃ 4 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃2 min，循环扩增30次；72 ℃ 10min。PCR产物采用上海华舜公司胶回收(小量)试剂盒回收。

1.5　重组表达质粒的构建

原核表达载体pET30(a)用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切；扩增的4个毒株的NP基因分别先用BsmBⅠ酶切，然后用T4DNA聚合酶进行3′末端平滑化处理，再用HindⅢ酶切。用T4DNA连接酶分别将酶切后纯化的PCR产物与双酶切纯化的pET30(a)载体连接，转化TOP10大肠埃希菌感受态细胞，然后各取100μL菌液分别涂布于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板上，37 ℃培养16 h。挑取白色孤立菌落，接种于5mL含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培养基中，37 ℃培养12h。阳性质粒用质粒(小量)抽提试剂盒提取，分别命名为pET30(a)­H1­NP、pET30(a)­H3­NP、pET30(a)­H5­NP、pET30(a)­H9­NP。

1.6　重组表达载体的鉴定与序列测定

取pET30(a)­H1­NP、pET30(a)­H3­NP、pET30(a)­H5­NP、pET30(a)­H9­NP用限制性内切酶NotⅠ和NdeⅠ进行双酶切鉴定。取酶切鉴定为阳性重组质粒的菌液，送Invitrogen公司进行序列测定。

1.7　NP蛋白在大肠埃希菌中表达

取重组阳性质粒pET30(a)­H1­NP、pET30(a)­H3­NP、pET30(a)­H5­NP、pET30(a)­H9­NP转化DE3大肠埃希菌感受态细胞，然后各取100μL菌液涂布于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板上。37 ℃培养16 h。挑取白色孤立菌落，分别接种于5mL含有卡那霉素(50 μg/mL )的LB培养基中，37 ℃培养过夜。然后各取100 μL菌液(剩余菌液加入150mL/L的甘油置－20 ℃冻存)加入到10 mL的LB培养基中，37 ℃震荡培养至OD_{600 nm}为0.5时，分别取100 μL诱导前菌液作为阴性对照，其余加IPTG至终浓度为0.3 mmol/L进行诱导，继续培养8h，分别在诱导后2、4、6、8 h取样，每次100 μL。样品以4 000 r/min离心2 min，弃去上清，沉淀加入100μL的1×SDS­PAGE上样缓冲液，置－20 ℃保存备用。

1.8　表达产物的检测

1.8.1　SDS­PAGE电泳　将多次采集的样品经震荡悬浮后，在沸水中煮5 min，取15 μL加于100 g/LSDS­PAGE胶，电泳2 h左右，考马斯亮蓝染色，脱色后观察结果。

1.8.2　Westernblot免疫印迹检测　对LM2株重组NP蛋白SDS­PAGE电泳后的胶进行电转印，转印后的硝酸纤维素膜放入含50g/L脱脂奶粉的PBS封闭液中4 ℃封闭过夜；将硝酸纤维素膜剪成条，分别与1∶250倍稀释的LM2株和W2株攻毒的鼠高免血清室温作用2h，TBS洗涤3次，每次10 min，再分别与1∶2 500倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗室温作用2h，TBS洗涤3次，每次10 min，最后用DAB显色试剂盒显色，拍照记录。

1.9　在不同条件下对BXL、W2和DP株NP蛋白进行表达的试验

1.9.1　改变IPTG浓度　分别将含有pET30(a)­H3­NP、pET30(a)­H5­NP和pET30(a)­H9­NP阳性重组质粒的菌液在37℃震荡培养至OD_{600 nm}为0.5时，加入IPTG进行诱导，诱导浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2 mmol/L，继续培养12 h，每3h取样1次，每次100 μL。样品以4 000 r/min离心2 min，弃去上清，沉淀加入100μL的1×SDS­PAGE上样缓冲液，进行SDS­PAGE电泳。

1.9.2　改变温度IPTG　诱导浓度为0.3mmol/L，将含有pET30(a)­H3­NP、pET30(a)­H5­NP和pET30(a)­H9­NP阳性重组质粒的菌液分别在25℃和30 ℃温箱中震荡培养，继续培养12 h，每3 h取样1次，每次100 μL。样品4 000 r/min离心2min，弃去上清，沉淀加入100 μL的1×SDS­PAGE上样缓冲液，进行SDS­PAGE电泳。

1.10　LM2株重组NP蛋白的纯化

将含有pET30(a)­H1­NP阳性重组质粒的菌液按照1∶1 000比例接种于1L含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，IPTG浓度为0.3 mmol/L诱导8 h。菌液以8 000 r/min离心10min，弃去上清，沉淀用PBS重悬后，进行超声波处理，直至液体呈透明状态，超声处理的产物再经12 000 r/min离心30min，分离上清与沉淀，上清用带有组氨酸标签的蛋白纯化试剂盒进行纯化，用BCA法蛋白定量试剂盒测定重组NP蛋白的浓度。

2　结果

2.1　4个毒株NP基因的RT­PCR扩增

4个毒株的RT­PCR产物在10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，扩增的片段大小约1 500 bp左右，与预期大小相符(图1)。

2.2　重组质粒酶切的鉴定

对重组质粒用限制性内切酶NotⅠ和NdeⅠ进行双酶切鉴定，得到的两个片段，与预期大小相符，说明重组质粒构建成功(图2)。

2.3　序列分析

测序结果分析表明克隆的4个毒株的NP基因已分别插入到载体相应的位置，并且二者均从编码第8个氨基酸的核苷酸序列开始，与设计方案一致。根据4个毒株NP基因核苷酸序列推导的氨基酸序列分析发现，4个毒株共有61处氨基酸不同(图3)。

1.DNA标准DL 2 000；2～5.LM2、BXL、W2、DP 4个毒株NP基因RT­PCR结果　

1.DNA Marker DL2 000；2­5.NP products of LM2、BXL、W2、DP

图1　4个毒株NP基因RT­PCR扩增结果

Fig.1　RT­PCR products of NP gene of four strains

1.DNA标准DL 2000；2～5.pET30(a)­H1­NP、pET30(a)­H3­NP、pET30(a)­H5­NP、pET30(a)­H9­NP

1.DNA Marker DL 2000；2­5.pET30(a)­H1­NP、pET30(a)­H5­NP、pET30(a)­H9­NP；

图2　4个毒株重组质粒酶切鉴定结果

Fig.2　Identification of the recombinant plasmid of four strains

“－”表示缺失的氨基酸序列；“···”表示相同的氨基酸序列

“－”Means deleted amino acid sequence；“···”Means the same amino acidsequence as above

图3　4株流感病毒NP基因的推导氨基酸序列

Fig.3　The deduced amino acid sequenc of 4 strains

2.4　重组NP蛋白SDS­PAGE电泳及Western blot检测

转化重组质粒后的DE3细菌以0.3 mmol/L的IPTG诱导，细菌裂解物上清进行100g/L的SDS­PAGE电泳，发现LM2株病毒NP蛋白得到表达，并且重组NP蛋白在诱导后4、6、8 h都有表达，且在诱导后8h目的蛋白的表达量最大(图4)。Westernblot检测表明，该重组蛋白既能与H1N1亚型猪流感病毒LM2株鼠的高免血清发生特异性反应(图5)，又能和H5N1亚型禽流感病毒W2株鼠的高免血清发生特异性反应(图6)。而BXL、W2和DP株重组NP蛋白未获得表达；在分别对IPTG诱导浓度与温度等表达条件进行优化后，仍未获得重组NP蛋白。

2.5　NP融合表达蛋白的纯化

LM2株重组NP蛋白的上清用带有组氨酸标签的蛋白纯化试剂盒进行纯化，经过SDS­PAGE检测纯化结果后，利用BCA法蛋白定量试剂盒测定其浓度，浓度达250μg/mL，纯度在95%以上(图7)。

1.诱导8 h上清中的表达产物；2.空质粒诱导8 h上清对照；4.诱导8 h沉淀中的表达产物；5.空质粒诱导8h沉淀对照；3,6.蛋白分子质量标准

1.pET30(a)­H1­NP in DE3 induced for 8 h (supernatant)；2.pET30(a) inDE3 induced for 8 h (supernatant)；4.pET30(a)­H1­NP in DE3 inducedfor 8 h (precipitate)；.pET30(a) in DE3 induced for 8h(precipitate)；3,6.Protein molecular weight Marker

图4　NP基因经IPTG诱导后表达产物的SDS­PAGE分析

Fig.4　SDS­PAGE analysis of the expression ofNP in E.coil DE3post­induction

1.空质粒对照；2.重组NP蛋白上清的检测；3.重组NP蛋白沉淀的检测；4.蛋白分子质量标准

1.Expression products of E.coli containing pET30(a)；2.Detection ofsupernatant；3.Detection of precipitate；

4.Protein molecular weight Marker

图5　LM2株鼠高免血清对LM2株重组NP蛋白的Western blot检测

Fig.5　Western blot analysis of recombinant nucleoprotien of LM2withserum of LM2 strain

1.重组NP上清蛋白；2.重组NP沉淀蛋白；3.蛋白分子质量标准；4.空质粒性对照

1.Detection of supernatant；2.Detection of precipitate；3.Proteinmolecular weight Marker；4.Expression

图6　W2株鼠高免血清对LM2株重组NP蛋白的

Fig.6　Western blot analysis of recombinant NP of LM2 with serum ofW2 strain

1,2.重组NP蛋白上清的纯化产物；3.蛋白分子质量标准

1,2.The purified NP of LM2 strain；3.Protein molecular weightMarker；products of E.coli containing pET30(a)

图7　LM2株重组NP蛋白上清纯化产物的SDS­PAGE分析Western blot检测

Fig.7　SDS­PAGE analysis of purified NP protein ofLM2 strain

3　讨论

本研究对A/Swine/Guangdong/LM2/05(H1N1)、A/Swine/Henan/BXL/04(H3N2)、A/Chicken/Guangdong/W2/04(H5N1)、A/Duck/Guangdong/DP/04(H9N2)4个毒株的NP蛋白进行克隆，构建了原核表达载体，重组质粒在大肠埃希菌中进行诱导表达。结果H1N1亚型猪流感病毒NP蛋白得到表达，并且重组蛋白在上清和包涵体中同时存在；Westernblot检测表明，该重组NP蛋白能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应，说明其具有良好的反应活性和交叉反应性；而对H3N2、H5N1和H9N2亚型流感病毒的NP蛋白在相同条件下进行表达未获得重组蛋白，改变诱导表达的条件，仍未获得成功。

同时对4株不同亚型流感病毒的NP基因采用相同的方法在大肠埃希菌中进行表达，但是仅获得H1N1亚型流感病毒的重组NP蛋白；而H3N2、H5N1和H9N2亚型流感病毒NP蛋白未见表达，对温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化后，仍未获得表达，这与文献报道不一致^[5­9]。之前曾经对H5N1亚型禽流感病毒NP蛋白部分序列采用相同的方法进行过表达，也未获得重组的NP蛋白。分析原因一方面可能是由编码氨基酸的核苷酸序列差异，导致不同毒株NP蛋白在氨基酸方面的差异所造成；另一方面也可能是我们对原核表达的方法还没真正掌握，具体原因还不清楚，有待进一步研究。

在以大肠埃希菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常在细胞内形成包涵体。包涵体的形成有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解，并且非常有利于分离表达产物。但包涵体形成后，往往表达蛋白不具有生物活性^[10]。本试验利用高效的pET30(a)原核表达系统对H1N1亚型猪流感病毒NP蛋白成功进行了表达，重组NP蛋白在菌液中的表达量占菌体总蛋白的20%以上。SDS­PAGE显示，表达的重组蛋白在上清和包涵体中同时存在。对上清和包涵体进行Westernblot检测，二者均可与H1N1和H5N1亚型流感病毒鼠的高免血清发生特异性反应。这一结果不仅说明重组NP蛋白具有天然流感病毒NP蛋白的抗原性，而且具有良好的交叉反应性。以NP为诊断抗原，可检测所有A型禽流感病毒抗体，这对于建立以重组NP蛋白为包被抗原的检测方法是非常有利，省去了表达各种不同亚型NP蛋白的麻烦。

目前，流感病毒进行检测的方法主要有血凝和血凝抑制试验(HA和HI)，琼脂扩散试验(AGIP)，酶联免疫吸附试验(ELISA)。HI试验敏感性很低；而且又因血清中可能含有非特异性红细胞凝集物和非特异性血凝抑制物，特别是猪的血清，为了提高其敏感性，需要进行预处理^[11­12]，而导致操作复杂。虽然AGIP和ELISA有操作简单，结果容易判定的优点，但其敏感性和HI一样偏低。为了保证AGIP和ELISA检测的特异性和敏感性，这就要求使用的重组抗原有较高的纯度和免疫反应活性。很多研究者应用多种方法来制备诊断抗原，得到的都是病毒抗原的混合物，其中混有杂蛋白。陈艳等^[13]利用全病毒感染鸡胚尿囊腔制备抗原，结果抗原中可能混有鸡胚杂蛋白，而且存在散毒的危险；李海燕等^[14­16]用杆状病毒表达系统在sf9细胞中表达NP蛋白，该方法虽然避免了全病毒作为抗原存在的生物安全性问题，但结果可能混有细胞自身蛋白，对诊断结果都可能有一定的影响。而且这些方法成本高，特异性差。因此，需要寻求一种高效的、低成本且生物安全性高的抗原制备方法。本试验的开展，对提高AGIP和ELISA方法的特异性、敏感性有重要的作用，为流感病毒的诊断，尤其是未知亚型抗原、抗体检测奠定了良好的技术基础。同时，由于原核表达系统具有成本低和表达量高等优点，所以本研究在流感病毒诊断试剂的开发、亚单位疫苗的研制和蛋白功能的研究等方面具有广泛的应用前景。