摘 要：赤羽病是由阿卡班病毒引起牛、羊等动物流产、死产、死胎、胎儿畸形、以及先天性关节弯曲积水性无脑综合征的一种虫媒传染病。20世纪30年代该病在澳大利亚羊群中首次暴发。近年来，我国许多省也流行本病，给畜牧业带来巨大损失。文章对该病的病原、流行病学、发病机理、抗原、诊断进行综述，为有效防控赤羽病提供参考。
关键词：阿卡班病毒；库蠓；流行病学；诊断
赤羽病也称阿卡班病，是由阿卡班病毒(Akabanevirus，AKV)引起的牛、羊等动物流产、死产、死胎、胎儿畸形、以及先天性关节弯曲积水性无脑综合征(简称AH综合症)的一种虫媒性传染病。20世纪30年代，该病在澳大利亚羊群中首次暴发，而后1949年在日本也曾暴发，但到1961年才在日本群马县赤羽村的畜舍内采集的金色库蚊和三带喙库蚊中首次分离到病毒，因此得名。此后澳大利亚、肯尼亚、以色列等国家也相继分离到病毒。1990年，证实该病在我国存在。1998年农业部动物检疫所的李其平等第一次在上海地区分离到3株阿卡班病毒。AK给畜牧业造成了严重的经济损失，是我国动物疾病防控和国际动物贸易中的重点检疫对象。
1 病原
阿卡班病毒属于布尼病毒科(Bunyaviridae)布尼病毒属辛布(Simbu)病毒血清群的一个亚群，为单股负链RNA病毒。该病毒粒子呈球形，直径为80nm～120 nm，外有囊膜，囊膜上有糖蛋白组成的5 nm～10nm的纤突。分子质量为300×106～400×106，沉降系数为350 S～475 S，在蔗糖中的浮密度为1.19g/cm3，在氯化铯中的浮密度为1.20 g/cm3。
阿卡班病毒的基因组由大(L)、中(M)、小(S)3个RNA片段构成。S RNA编码核衣壳蛋白(N)和非结构蛋白(NSs)，SRNA核苷酸序列和N蛋白氨基酸序列高度保守，N蛋白上存在3个抗原表位，具有群特异性，刺激机体产生抗体。MRNA编码两种囊膜糖蛋白(G1和G2)，具有型特异性，分别诱导产生中和抗体和血凝抑制抗体。此外，MRNA还编码1种或多种非结构蛋白(NSm)。L RNA编码460 ku的聚合酶，能够催化病毒RNA转录生成mRNA。
该病毒不耐热，对乙醚和氯仿敏感，200 mL/L乙醚可在5 min内使其灭活。0.1%的β丙内酯在4 ℃下于3d内将其灭活。病毒于pH 6.0～10.0之间稳定，易被脂溶剂、紫外线和去垢剂等灭活，Mg2＋不能提高其抵抗力。
该病毒有凝集性，在高浓度NaCl和pH6.1条件下，能凝集雏鸡、鹅、鸭和鸽子的红细胞，不能凝集人、羊、牛、豚鼠及1日龄雏鸡的红细胞，但鸽子的红细胞凝集后溶血。病毒同时具有溶血性，在37℃下活性最强，反复冻融可增强其溶血活性，但冻融超过10次时，不再增强。
用多种细胞培养AKV均易增殖，并引起细胞病变。除可采用牛、羊、猪、豚鼠、鼠、仓鼠的肾原代细胞及鸡胚的成纤维细胞培养外，还可在Vero、Hmlu1、BHK21、ESK、PK15、BEK1、MDBK、RK15等各种传代细胞上传代培养，其中在Hmlu1细胞上和乳鼠脑内接种的易感性最高。该病毒能使MVPK1细胞和Hmlu1细胞形成蚀斑。
2 流行病学
2.1 易感动物和传播途径
孕期的牛、绵羊和山羊最易感，马、水牛、骆驼也可感染，人和猪的易感性较低。2003年台湾发现AKV能经过口鼻途径自然感染猪，并从其体内分离到NT14株AKV[1]。除家畜外非洲多种野生动物和东亚的猴也受到AKV的感染。我国在家畜体内已经检测到病毒抗体，但还没有发生疾病的报道。该病毒主要由吸血昆虫传播，蚊和库蠓是主要的传播昆虫。库蠓胸腔接种AKV后，病毒可在其体内复制，并能在体内持续9d以上。蚊子通过叮咬家畜的黏膜和上皮传播病毒。72%的雌蚊吸吮带毒动物血液后即可带毒，3 d～8d时病毒量达到最高值。此外，赤羽病毒还可通过母体垂直传播。
2.2 流行现状及分布
该病多发在蚊蠓孳生猖獗的季节和地区，具有明显的季节性和地区性。虫媒带毒后可借风力到达不同地区，再度叮咬易感动物引起流行。感染动物发生异常的时期从8月份到次年的3月份，其中8月份至9月份多为早产和流产，10月份至次年1月份多为体形异常，次年2月份至3月份多为大脑缺损。该病在一个地区一般间隔数年会重复流行，但发病的程度也许有所不同。首次流行中患病的牛羊，再次流行时一般不再发病。
除日本、澳大利亚和以色列外，随后又从非洲肯尼亚的按蚊、南非的羔羊和库蠓、沙特阿拉伯的羚羊、苏丹的山羊体内分离获得病毒。此外，从印度尼西亚的猪和猴、马来西亚和中国台湾省的猪、泰国的马、肯尼亚的牛、绵羊、山羊、骆驼和马、科威特和巴林的牛等动物体内检出抗体。根据病毒分离和血清学调查，证明AKV还存在于越南、菲律宾、朝鲜、斯里兰卡和印度尼西亚。由此可见，AKV可能广泛分布于热带和温带的广大地区。我国从20世纪90年代初也发现了本病流行，经证实我国上海、山东、天津、安徽、湖南、广东、北京、天津、河北、陕西、内蒙古、云南等地都有过地方性流行，该病的发生给畜牧业造成了巨大损失。
3 发病机理
AKV的细胞受体在中枢神经系统[2]。AKV对神经元和星形神经胶质细胞易感，不感染小神经胶质细胞[3]。AKV在细胞培养物中还能引起被感染细胞的凋亡，可能与病毒的发病机理有关[4]。
感染动物一般不表现临床症状。妊娠母畜感染AKV后随血流增殖，并持续存在于胎盘子叶的滋养层细胞、胎儿中枢神经系统和骨骼肌中未充分发育和分裂的细胞，导致坏死性脑脊髓炎和多发性肌炎。如果胎儿幸存下来，细胞的这些损伤就表现为关节弯曲、积水性无脑、脑穿通、脑过小、脑水肿、脑脊髓炎。由于胚胎期细胞比较脆弱，胚胎早期胎儿不具有免疫力，因此胚胎感染越早，对其损伤就越严重。如果是在细胞分化的器官形成期感染AKV，可完全阻断器官的发育成熟。在胚胎晚期感染AKV，将引起脑和脊髓的非化脓性炎症、早产、死产或流产，受感染的犊畜不能存活。感染的病毒病粒子或病毒抗原出现在胎牛的大脑，脊髓和骨骼肌。
4 病理变化
病理变化主要为先天性关节弯曲积水性无脑综合征(简称AH综合征)。病变特征与孕牛受感染的时间有关。怀孕3个月至4个月的母牛感染后出生的牛犊常出现无脑症病变，而关节弯曲常为孕牛在妊娠4个月至6个月时感染病毒所致。组织学检查胎儿呈现出非化脓性脑脊髓炎和多发性肌炎，流产或早产的胎儿病变最为严重，存活的胎儿则发生脑脊髓病变脑水肿或在神经内发生海绵样病变，脊髓腹角的运动细胞明显减少。
AKV能实验感染啮齿类动物，成年鼠脑内接种可以发生致死性脑炎，腹腔内接种则无感染性，怀孕仓鼠接种可导致胎儿的致死性感染，出现死产；接种6日龄鸡胚卵黄囊或15日龄鸡胚静脉接种，则出现类似于牛羊AH综合症的病理学变化，脑新纹状体和视叶发生灶性炎性病变，脑缺损、积水、关节弯曲等，因此鸡胚可用作研究AKV的实用模型。
5 抗原性
在迄今分离到的AKV株中，没有发现有不同血清型存在。AKV与辛布群中的其他成员在交叉补体结合试验中表现有共同的群抗原，但在中和试验、血凝抑制试验和溶血抑制试验中具有很高的特异性，不出现交叉反应。
AKV具有抗原多样性的特点，可能有不同的基因型，即AKV可能是一个由不同基因型构成的单基因库[57]。花群义等[8]根据SRNA的绘制了系统发育树，并将18株病毒分成3个族，证明AKV病毒以多谱系进化，也说明了抗原的多样性。
6 诊断
6.1 病原学诊断
6.1.1 直接镜检 取病畜的血、肺、肝和脾及胎儿、胎盘和脑组织材料制成超薄切片负染，在电镜下检查病毒并观察其形态特征，病毒呈球形，直径80nm～120 nm，有囊膜。
6.1.2 病毒分离鉴定 分离并鉴定病毒是最好的确诊方法。从成年动物分离病毒比较困难，因其缺乏临床症状，难于掌握病毒血症时期，通常从流产的胎儿和死胎中分离病毒。将胎儿的各种病料，特别是脑、脑室液、脊髓、肌肉、胎儿、胎盘以及肺、肝、脾等混合病料接种于乳鼠脑内或Vero、Hmlu1和BHK21等细胞，一般都易分离获得病毒。也可先接种鸡胚卵黄囊，再从病变鸡胚分离病毒。随后即可用特异免疫血清进行中和试验或补体结合试验等鉴定病毒。
6.2 血清学诊断
AKV与辛布群中的其他成员在交叉补体结合试验中表现有共同的群抗原，但在中和试验、血凝抑制试验和溶血抑制试验中具有很高的特异性，不出现交叉反应。
6.2.1 琼脂凝胶扩散沉淀试验(ADIG) 是一种快速检测方法，能够检出Aino、Tinaroo和Peaton病毒抗体。刘焕章等[9]应用引自美国和日本的赤羽病病毒和标准阳性血清，制备了琼脂免疫扩散试验抗原和高免血清，建立了赤羽病琼脂免疫扩散试验诊断方法。此法操作简便，能很快得到试验结果，但不如中和试验敏感。
6.2.2 血凝抑制试验(HI) AKV能凝集雏鸡、鸽、鸭和鹅的红细胞，该凝集反应可被感染AKV的动物血清抑制。ItoH等[10]发现用甲醛处理过的鹅红细胞代替新鲜的鹅红细胞，能提高红细胞的凝集性，并且不依赖盐浓度，这样方便了对AKV的免疫学研究。抗凝剂肝素会抑制AKV的血凝活性，肝素结合AKV的血凝成分，而不是红细胞，所以，用肝素化的细胞分离AKV并不理想[11]。
6.2.3 微量血清中和试验(SN) 康复动物及新生而未吃初乳的仔畜血清中存在能中和AKV的抗体。将已知AKV与可疑动物血清混合后接种于1日龄～2日龄小鼠脑内或7日龄～9日龄鸡胚的卵黄囊内，该试验也可在Vero、Hmlu1、BHK21细胞上进行。微量血清中和试验成功的关键是抗原的纯度和效价及标准阳性血清的质量。该法为目前我国进口种畜中AKV的主要检测方法，系农业行业标准。
6.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA) 日本的IdeS等[12]首次建立了检测牛血清中AKV抗体的ELISA方法；李健等[13]应用纯化的细胞毒在国内首次建立了间接ELISA试验，该方法快速，待检样品不需灭活，其特异性和敏感性均高于血清中和试验。花群义等[14]应用重组N基因表达的核蛋白抗原建立了间接ELISA试验，用重组核蛋白(N)抗原代替完整病毒作为ELISA检测用的标准抗原，克服了用全病毒所带来的生物安全隐患。该法已经作为我国进口种畜AKV的检测方法。鱼海琼等[15]用AKV的单克隆抗体建立了阻断ELISA检测赤羽病病毒血清抗体。TsudaT等[16]用AKV的中和单抗通过竞争ELISA检测牛血清中的AKV抗体。286份牛血清先用血清中和试验检测，再用竞争ELISA检测，竞争ELISA的相对特异性高于98%，而单个单抗的相对敏感性在49%～82.2%之间，表明竞争ELISA可作为检测AKV抗体的快速和特异性方法，且有可能替代血清中和试验。
6.2.5 间接荧光抗体法(IFNT) 李少英等[17]以兔抗赤羽病重组核蛋白血清作一抗，利用间接荧光抗体法在AKV感染的BHK21培养细胞和攻毒的乳鼠组织中检测到AKV抗原，此法特异性高且操作时间短。
6.3 分子生物学诊断
李健等[18]根据AKV的SRNA序列，设计合成3对引物，在国内第一次建立了检测AKV的RTPCR方法，能够敏感的检测出阳性样品。StramY等[19]从以色列中部的Volcan的库蠓中用荧光PCR检测到该病毒的S RNA片断，这也是第一次应用荧光定量PCR技术检测此病。
6.4 鉴别诊断
AKV与Aino病毒的SRNA的同源性高达73.5%,5′端非编码区的RNA序列同源性为55%，因此在对阿卡班的诊断时要注意与Aino病毒的非特异性反应。
StuartD等[20]选择Aino病毒制备单抗，筛选出一株能与辛布血清群所有病毒反应的群特异性单克隆抗体，作为群特异性间接ELISA的检测抗体，可对5种辛布血清群病毒(Akabane，Tinaroo，Peaton，Douglas，Aino)先进行血清群鉴定，再用这5种病毒分别制备多克隆抗体，作为型间接ELISA的检测抗体，可分别鉴别这5种病毒。此法能较为准确的检测辛布血清群的各种病毒。
Akashi H等[21]针对AKV和Aino病毒的SRNA给每个病毒各设计了两对病毒特异性引物，先进行病毒基因组的反转录，提纯后作为模板用特异性引物进行套式PCR。应用此方法，在被感染细胞的上清液中，Anio病毒的最低检测浓度达到10－3蚀斑形成单位，AKV的最低检测浓度达到10－5蚀斑形成单位。
Stram Y等[22]用Taqman探针以多重反转录荧光PCR法检测AKV和Aino病毒。SRNA序列经比对后设计引物和探针，确保AKV引物和探针只识别AKV而不识别Aino病毒，反之亦然。用VIC标记AKV的探针，FAM标记Aino的探针。以cDNA10倍系列稀释作为标准品绘制标准曲线对未知病毒样品进行定量。此法能检测到约3个～30个拷贝的病毒S RNA。
7 防控
Levin A等[23]比对了所有发表的SRNA序列后，选择两个同源性为100%的保守区域为靶序列设计了2个siRNA，第3个siRNA是针对两株澳大利亚分离株上只相差1个碱基的保守区域而设计的。单个siRNA分别转染细胞后对AKV的复制有99%的抑制作用，当同时把3个siRNA转染入细胞时，其抑制性可达100%。该研究表明，有望用siRNA控制赤羽病。
最可靠的预防方法是在流行期之前对妊娠家畜及预定配种的家畜进行赤羽病疫苗接种，可获得充分的免疫力。目前所用疫苗有活苗和灭活苗两种，活苗为30℃下，在Hmlu1细胞上致弱的弱毒疫苗，给牛免疫接种；灭活苗为OBE1灭活氢氧化铝苗，给牛注射2次，间隔4周，每次3mL，具有良好的保护作用。犊牛和妊娠羊在如上接种以后，用强毒进行攻击，不发生病毒血症和胎儿感染。
8 结语
赤羽病是家畜疾病中传染率及发病率很高的一种疾病，且由于感染动物一般不出现临床症状，不易在感染早期发现，该病在我国广泛存在，一旦暴发将给我国畜牧业造成严重的经济损失。虽然利用siRNA可以抑制AKV的复制，有望由此来治疗此病，但成本太高，所以应用快速准确的方法检测阿卡班病毒并防止其传播是极为重要的。加强进出口检疫防止病原传入，改善环境卫生，消灭吸血昆虫，制定计划定期进行疫苗接种，是预防本病的三项有效措施。