牛病毒性腹泻­黏膜病诊断方法研究进展

摘　要：牛病毒性腹泻­黏膜病是由黄病毒科、瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒引起的一种传染性疾病。该病以发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、怀孕母牛流产或产畸型胎儿为主要特征。该文就近几年来国内外对该病的实验室诊断方法，包括病毒分离、血清学试验、电镜观察、免疫荧光技术、聚合酶链反应技术等的研究概况进行了综述。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；分离与鉴定；诊断

牛病毒性腹泻­黏膜病是由黄病毒科、瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)，又称为牛病毒性腹泻­黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea­mucosal disease virus，BVD­MDV)引起的传染病，临床上以发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、怀孕母牛流产或产畸型胎儿为主要特征。该病呈世界性分布，广泛存在于美国、澳大利亚、英国、新西兰、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度等国家。李佑民等[1]首次从流产胎儿的脾脏中分离到BVDV。我国新疆、内蒙古、青海、河北、山东、四川等20多个省市自治区查出了该病[2­3]。由于BVDV与同属内的猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)和绵羊边界病毒(Border disease virus，BDV)存在抗原相关性，血清学上存在交叉反应，而且能够突破宿主特异性发生交叉感染，BVDV不仅可感染牛，也能感染绵羊、山羊、猪、鹿和其他反刍动物[4]。在我国进口动物检疫对象中，牛病毒性腹泻­黏膜病被列为二类传染病[5]。近年来我国奶牛进口数量急剧增加，该病已成为当前严重危害我国养牛业的传染病之一。由于大部分感染BVDV的牛不表现特征的临床症状和病理变化，而且引起腹泻和消化道黏膜糜烂或溃疡的疾病很多，所以确诊需进行实验室检查。实验室检测BVDV的主要方法有病毒分离鉴定、动物接种、血清学试验、免疫荧光技术、分子生物学技术等。

1　病毒分离鉴定

无菌采取发病牛的血液，反复冻融后加入抗生素，接种牛肾继代细胞或犊牛睾丸细胞，盲传几代后观察细胞病变情况。这种方法只能检测出致细胞病变(CP)型BVDV，而且由于非致细胞病变(NCP)型BVDV株常能干扰另一株有致细胞病变作用的毒株产生细胞病变，因此还需应用蚀斑减数试验等方法证明这类毒株的存在[6]。张保宁等[7­8]从河北省某规模化奶牛场牛病毒性腹泻­黏膜病疑似病例中采集病料，将处理好的病料接种MDBK细胞，盲传9代，在MDBK细胞上产生细胞病变，主要表现为细胞界限不清、细胞内空泡和细胞层形成空斑，与标准毒株产生的细胞病变相同。经双抗体夹心ELISA检测，结果表明分离到的毒株为BVDV。病毒分离鉴定诊断可靠，但操作麻烦，耗时费力，且分离率较低，不适合大规模的流行病学调查。

2　琼脂扩散试验

取糜烂或溃疡病变组织周围的黏膜，不经任何处理，直接与抗BVDV阳性血清进行琼脂扩散试验。据统计，约有60%的病牛呈现阳性反应。这种方法操作简便、快速，但特异性差，检出率低，易造成漏诊、漏检。据试验报道，琼脂扩散试验与微量中和试验(neutralization test technique，NT)阳性率之间差异极显著(P＜0.01)。

另外，还可以用标准 BVDV抗原来检测血请中的抗体。这种方法只能粗略测定被检血清中的抗体效价，其敏感性不如血清中和试验。Hopkinson等用细胞抗原检测164份血清，发现中和试验中和滴度1∶8以上的血清，琼脂扩散试验全部为阳性；2份滴度为1∶4的血清，琼脂扩散试验为阴性；23份滴度低于1∶2的血清，琼脂扩散试验全部为阴性。证明琼脂扩散试验仍不能取代中和试验[1]。由于许多持续性感染动物处于免疫耐受状态，虽然体内不产生抗体，却可终生带毒、排毒，而且BVDV与CSFV、BDV之间有广泛的血清学交叉反应，故琼脂扩散试验准确性不高，但操作简便、快速、经济适用，可以作为生产实践中进行流行病学调查的手段之一。

3　中和试验

病毒中和试验(neutralization test，NT)是用牛睾丸或犊牛肾细胞培养的病毒与被检血清作用后再接种牛睾丸或犊牛肾细胞，观察细胞病变情况，这种方法是进行BVDV流行病学调查的有效手段。用双份血清(间隔3周～4周)倍比稀释后进行中和试验，滴度升高4倍以上判为阳性，本法既可以定性，又可用来定量，检出率较琼脂扩散试验高，而且重复性好，是常用的实验室检测方法。但由于许多持续性感染动物处于免疫耐受状态，虽然体内不产生抗体，却可终生带毒、排毒，因而，仅凭检查抗体难以查出这部分传染源。

4　动物接种法

取待检病料，用灭菌的组织捣碎器研磨，加入pH 7.4 PBS进行1∶5稀释，8 000 r/min离心30 min，取上清液加入双抗，接种6月龄健康犊牛，每头犊牛接种50 mL，其中40 mL静脉注射，10 mL滴鼻接种[1]。此后每天进行临床观察和体温测量，并定期采血进行病毒分离和血清抗体检测。这种方法费时且不经济，在实践中难以推广应用，只适用于实验室进行病原分离检测，不适合批量检测。

5　电镜检查

可将采取的新病料或细胞培养物用超速离心等方法浓缩，直接用负染法在电镜下观察(directly electromicroscopy， DEM)病毒粒子的特征，也可制作成超薄切片标本检查，或用铬投射的电子显微照相测量病毒粒子的大小和形态。病毒粒子存在于胞浆、空泡和扩张的内质网池内，形态比较规整。此法方便快捷，非常直观，但用电镜检出病毒粒子的最低数量要达到 10个/mL，因此需用超速离心等方法浓缩病毒液。由于有相似病毒粒子的干扰，其特异性和敏感性较差。赵月兰等[9]从疑似病例中采集病料接种MDBK细胞，盲传9代后，电镜观察其细胞培养物，可见圆形、直径为40 nm～60 nm，有囊膜，囊膜表面有突起的病毒粒子，与BVDV颗粒基本一致，用理化及生物学方法对其进行检测，分离毒与BVDV Oregon C24V具有相同的理化特性和生物学特性，证明分离到的是不产生细胞病变的BVDV毒株。电镜检查诊断虽然比较可靠，但需要昂贵的试验仪器，只适用于实验室进行检测。

蛋白A胶体金免疫电镜(protein A­gold immunoelectron microscopy，PAG­IEM)技术可迅速扫描网格，以较低的放大倍数检出病毒粒子。常国权等应用PAG­IEM和DEM技术检测了临床上疑似BVDV感染的牛粪便样品，结果表明，在电镜下可见集堆的抗原－抗体复合物形成的抗体桥，在抗体桥上可见到病毒粒子。胶体金颗粒通过抗体桥分布在病毒粒子周围，病毒结构清晰。PAG­IEM不仅快速(3 h～4 h即可报告诊断结果)，而且敏感(比DEM检查敏感1 000倍以上)。虽然PAG­IEM不适用于大量样品的筛选，但对于检查经过挑选的或可疑样品内的病毒粒子则是一种特异敏感、快速的检测方法。

6　免疫荧光技术

免疫荧光技术(immunofluorescence technique， IFT)通过显微镜标本的免疫荧光染色而显示其结果，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术发展的基础上建立起的一项技术，把免疫学的特异性、敏感性和显微镜的精确性有机结合起来，从而成为广泛应用的免疫学技术，此法特异、敏感、快速。IFT通常使用直接法检测感染细胞培养物及病变组织冰冻切片中的病毒粒子，荧光颗粒出现于胞浆中，并可用未标记抗体进行荧光抑制试验做进一步鉴定。魏志强等对BVDV感染牛的白细胞和血清荧光抗体检测的比较表明，白细胞和血清中病毒消长情况差异不大，血清荧光抗体检测出现特异性荧光即可判为阳性。用间接免疫荧光抗体法检测牛血清中的抗体，结果与中和试验符合率达98.63%。这种方法具有特异、敏感、快速的优点，且适合检查非细胞病变生物型的细胞培养物，常应用于我国进出口牛羊检疫中[9]，但因其需要荧光显微镜，不适于基层兽医检测。

7　酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)是以物理方法将抗体(或抗原)吸附在固相载体上，随后的一系列免疫学和生物化学反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定试验，它是检测器官或组织培养物中的BVDV或监测牛群中BVDV抗体水平及潜伏感染情况的一种良好技术。王新平建立了双抗体阻断ELISA检测血清中的抗体，其敏感性比中和试验高出5个滴度。由于检测抗体难以做出早期诊断，王新平等又建立了双抗体夹心ELISA检测BVDV，并研制了试剂盒，克服了间接ELIAS和中和试验及琼脂扩散试验的一些缺点，是一种特异、敏感、快速、操作简便的诊断方法。Saliki J H等[10]用病毒分离和夹心ELISA两种方法进行试验，共检测408份牛血清样品，病毒分离法检测172份血清阳性，夹心ELISA对这172份阳性样品和236份病毒分离检测阴性的样品进行了检测，结果敏感性和特异性均为100%。赵月兰等[11]采用改进的双抗体夹心ELISA对1 030份奶牛腹泻粪样进行了BVDV抗原检测，病毒抗原最高检出率为81.4%。双抗体夹心ELISA是通过检测病料中的病毒抗原来检测动物是否感染BVDV，该方法操作简便、费用低，可用于大批量样本的检疫，更重要的是它能从病料中检出持续性感染的动物，所以该方法非常适用于临床的诊断和检疫。

Shannon利用BVDV单克隆抗体建立了抗原捕获ELISA法检测BVDV抗原。Horner对这种方法进行了改善，和PCR与中和试验进行了比较，认为此法更适合大规模检测BVDV抗原。张光辉[12]建立了单克隆抗体双抗体夹心ELISA，试验结果表明这种方法具有良好的特异性、敏感性及稳定性，与病毒分离试验对比结果为阳性符合率86.67%，与中和试验对比结果为阳性符合率93.33%，最低病毒检出量为200 ng/mL，但这两种方法需要单克隆抗体，费用昂贵，且不易获得。Katz J A等[13]对147份已知状况的胎牛血清用竞争性阻断ELISA和NT两种方法进行了试验，结果表明，使用未稀释胎牛血清和稀释的犊牛抗BVDV抗血清得到的结果符合率很高，且不需高纯度抗原。

利用E0、E2和NS3重组蛋白制备的ELISA重组抗原可检测同时BVDV E0、E2和NS3的抗体，具有较高敏感性和准确性，可作为检测BVDV血清抗体的早期诊断方法[14]。

河北农业大学动物医学实验室建立了双抗体夹心斑点酶联免疫吸附法(Dot­ELISA)和间接Dot­ELISA法，并应用建立的方法对78份腹泻奶牛血样检测，结果BVDV阳性检出率分别为57.69%、55.13%，而AGP法的阳性检出率是34.62%。经检验分析，建立的方法与AGP法相比较，阳性检出率差异显著。证实这两种方法检出率高、具有高度敏感性和特异性，只需要3 h～4 h即可得出结果且结果判断直观，适用于基层单位对BVDV的检测和流行病学调查[15]。

8　免疫过氧化物酶技术

免疫过氧化物酶技术(immune peroxidase technique，IPT)用于BVDV抗原检测和血清抗体的检测，也可用于检测BVDV抗原的总体分布。Allan等建立了福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中的BVDV抗原的链亲和素­生物过氧化物酶检测方法检测BVDV。Thur B等应用标记链亲和素­生物素过氧化物酶法对284头腹泻牛进行检测，结果665头阳性。Katz等建立了间接免疫过氧化物酶染色法检测BVDV感染细胞情况，被感染的单层细胞着色明显，未被感染的单层细胞无色。用高免血清和生物素化抗猪抗体­链酶亲和素过氧化物酶检测系统结合，可用于检测持续性病毒血症牛各种组织中病毒抗原的分布。据报道，用IPT和反转录­多聚酶链反应(reverse transcription­polymerase chain reaction，RT­PCR)检测41头BVDV感染的奶牛和一群小母牛的血清样品403份，均检出BVDV阳性样品48份[12]。Saino H等[16]用该法在血清和淋巴细胞中检测到BVDV。免疫过氧化物酶染色法与直接免疫荧光法对病毒悬液终点稀释度的测定，具有相同的敏感性，而且免疫过氧化物酶染色法染色的单层细胞可用肉眼观察，也可用显微镜观察出来。

9　核酸杂交技术

核酸杂交技术(nucleic acid hybridization，NHA)是20世纪80年代发展起来的一类新的检测技术和研究手段，其基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链，与传统的方法如免疫学方法和血清学方法相比，核酸杂交技术敏感，非常特异，而且应用广泛，不仅可以直接检测细胞和脏器组织中的BVDV，还可以对病毒分型。杨玉莹等利用光敏生物素标记制备的BVDV核酸探针检测BVDV，结果表明其敏感性比常规免疫学方法高出三分之一。根据BVDV基因序列的结构特点，在编码非结构蛋白p125高度保守基因区内，设计合成的引物，可扩增国外、国内不同CP型和NCP型毒株的p125编码区的基因。对某些存在外源序列插入的CP型(NADL株)毒株，经 PCR能扩增600 bp基因片段，而其他CP型和NCP型毒株扩增核酸片段约为400 bp左右，与BVDV的基因结构研究的结果相符合。王伟利等[17]用地高辛作为标记物制备了核酸探针，可与CP型和NCP型的BVDV的cDNA杂交，能检出1 pg的BVDV基因核酸。该探针不能与同属的猪瘟病毒及与其有相似临床症状的其他病毒的核酸杂交，说明该探针不仅具有高度的敏感性，而且具有高度特异性。Jimmy K等以NADL株的4种不同基因组区域作为杂交探针(P80、P54、gP53、gP62)，于斑点杂交试验中检测BVDV的24个细胞病变株和37个非细胞病变株，结果CP型的检出率达92%～96%，表明NAH技术是一种重复性好、特异性强的检测方法，但对NCP株的检出率只有75%～79%，说明该方法不适用于NCP株的检测[18]。

因核酸探针技术具有高度敏感性和特异性，操作方法简便，可在同一张检测膜上进行几个、几十个甚至几百个样品的检测，检测结果比较稳定，重复性好，因而为临床疫病的诊断和流行病调查提供了一种安全方便、快速经济的诊断方法。

10　聚合酶链反应技术

根据BVDV基因序列合成一对或数对引物，应用RT­PCR可以高度特异、灵敏、快速(数小时之内即可出结果)地检测器官、组织、血液、排泄物、培养细胞中的BVDV，并可与不同的BVDV株或与CSFV、BDV相区别。RT­PCR不仅具有可测定BVDV核酸序列的优点，即使BVDV被灭活，仍可用该方法检测。

Radwan等利用位于BVDV基因保守区3′ 端设计了一对引物，用反转录酶转录为cDNA，然后运用PCR技术进行特异性扩增，结果得到了BVDV cDNA中的一个250 bp的靶序列，用以检测细胞培养繁殖的BVDV标准株和数种非相关的CP和NCP型田间分离株以及临床血清样品中的BVDV。此法敏感性可达到检测一个克隆的cDNA分子。李立[16]建立了反转录多聚酶链反应方法，根据BVDV NADL株、Oregon C24V、BVDV地方分离株和猪瘟兔化弱毒疫苗株等不同毒株的RNA进行了提取、反转录、PCR和套式PCR扩增，用外部引物扩增BVDV和猪瘟病毒获得了280 bp的片段，用内部引物扩增第一次PCR产物，3株BVDV获得191 bp的片段，猪瘟病毒扩增结果为阴性，该方法最低可检测到10－1 TCLD50浓度的病毒。

Kim等对632份样品进行了病毒分离和RT­PCR检测，结果RT­PCR的敏感性达100%，特异性为96.2%[19]。日本学者Vrund K等选用BVDV基因的P80区片段作引物，建立了反转录多聚酶链反应方法检测BVDV，用RT­PCR检出了所有供试的17株BVDV株，包括致细胞病变株和非致细胞病变株。从5头患黏膜病、流产或腹泻的牛中采集了40份血清和组织样品，结果RT­PCR法从所有样品中检出了BVDV，而用病毒分离法从犊牛采集的10份样品没有分离到病毒，说明用RT­PCR法的检出率比病毒分离法更敏感。

Bhudevi B用单管荧光PCR对BVDV进行检测的病毒分型，选择双标记荧光探针，两个荧光探针是针对5′ 端非编码区区分BVDV­Ⅰ和BVDV­Ⅱ型。这种方法不仅快速、特异、敏感，而且可以对病毒RNA定量和分类[19]。

朱沙等[20]根据BVDV 5′ 端非编码区设计两套引物，建立了反转录套式PCR，可检测出处于免疫耐受状态机体中BVDV，并可与猪瘟病毒和羊边界病毒进行区分，为BVDV的检测提供了一种科学方法。杨桂梅等[21]设计合成了两对能分别扩增水泡性口炎病毒VSV(202 bp)和BVDV(341 bp)基因片段的引物，并对PCR扩增条件进行了优化，建立了二重RT­PCR方法，可同时检测VSV与BVDV病毒核酸，表明这是一种经济、快速、特异的方法。

国外陆续有BVDV多重PCR检测方法的建立的报道[22­25]，实践证明，这种检测BVDV的方法非常有效。用PCR方法诊断和检测BVDV具有敏感性高、特异性强、简便快速等优点，但由于基因扩增所需的仪器和试剂价格昂贵，引物合成比较困难，还不能广泛应用于生产实践。

11　结语

BVDV引起的牛病毒性腹泻­黏膜病迄今还无有效的治疗方法，且疫苗预防效果不理想。随着我国奶牛养殖业的迅速发展，牛病毒性腹泻­黏膜病已在我国流行。国内外对BVDV的检测技术进行了大量的研究，已建立了多种方法成功地检测BVDV的抗原、抗体和核酸，但都各有优缺点。随着对BVDV的分子生物学、免疫原性等方面的深入研究，希望建立更加快速、有效的监测体系，为有效的防控该病奠定良好的基础。