鸡传染性支气管炎病毒受体研究进展

摘　要：鸡传染性支气管炎是一种世界性分布的严重影响养鸡业的高度接触性传染病，其病原是一种最早发现的冠状病毒鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。IBV入侵细胞的受体是目前IBV研究中的热点之一。已知IBV囊膜上的纤突蛋白(S)是宿主组织和细胞嗜性及致病性的主要决定因素， S蛋白通常断裂为S1和S2 两部分，S1与宿主细胞膜上的细胞受体相结合，在S2的作用下病毒囊膜与宿主细胞膜融合，IBV与受体结合之后于中性或微碱性pH时发生构象改变，从而获得病毒进入宿主细胞的能力。对于IBV的受体研究主要集中于IBV可能使用的几种功能性受体，包括氨肽酶N、唾液酸、硫酸乙酰肝素等。

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)的病原是鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)，存在多种血清型，它们之间的抗原交叉反应微弱，使IB的防控较为困难。近年来，IBV或与其基因组类似的冠状病毒在禽类中不断发现[1­3]，越来越多的证据表明IBV比以前设想的具有更广的宿主范围。

IBV是一种冠状病毒，有囊膜，单股正链RNA，电镜下呈多形性，表面具有冠状病毒典型的表面纤突。IBV基因组大约27.6 kb。其基因组定位方式为：5′­[rep]­[S]­3a,3b,3c(E)­[M]­5a,5b­[N]­3′。

IBV的主要结构蛋白有纤突蛋白(S)、膜结合蛋白(M)、小膜蛋白(E)以及核衣壳蛋白(N)四种。其中S蛋白与病毒囊膜与细胞的融合以及病毒成功入侵细胞有关，S蛋白通常断裂为氨基端的S1以及羧基端的S2两部分。S蛋白已知的主要功能有：黏附宿主细胞表面受体分子以及活化病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，从而将病毒基因组释放进入宿主细胞[4]。

国内外对IBV的研究已有半个世纪，目前研究的焦点主要集中于IBV基因组S1基因，以及反向遗传学应用于研究基因组各组成结构的功能及其表达成分在病毒复制中的作用。然而，由于IBV的高变异率，尤其是IBV各血清型之间S1基因差异显著，相对保守区的缺乏，至今IBV S1中的受体结合位点尚未确定，对易感宿主细胞中的可能性受体也只是进行了一些探索性的研究，对IBV高亲和力的特异受体的确定还需要进一步的研究。本文拟对IBV S1基因的研究近况以及IBV的可能受体使用情况做一综述。

1　IBV基因组S1基因

1.1　IBV高度变异的可能原因

IBV S1基因变异率极高，不同血清型之间即使S1的微小差异也能导致交叉保护能力的下降或丧失。由于S1的高变异性，世界范围内分离的IBV血清型越来越多。导致这种进化特点的主要原因有：①内在特性，RNA基因变异率比较高；②持续使用活疫苗尤其是多价疫苗；③免疫种群持续存在病毒循环施加了强大的免疫压力，出现的点突变、基因缺失、插入以及重组等导致了变异的广泛存在[5]。

1.2　IBV S1基因裂解位点的研究

对S1基因的研究主要是确定S1区域高变区的范围以及S1与S2之间的裂解位点序列。Liu S W等[6]分析了中国1994年－2004年之间国内IBV分离株的遗传差异，他们把国内26株分离毒株与26株中国参考株及5株其他株进行了比较，大致将中国株分为7个型，表明IBV在使用疫苗之前就存在明显的遗传差异，而疫苗的使用增加了这种频率。Josiane T等[7]对巴西分离的IBV分析也表明遗传多样性在官方运用疫苗控制之前就已经出现并保留。

S蛋白的裂解位点通常是一对或几对碱性氨基酸，常见的是Arg­Arg­Ser­Arg­Arg[3]。但中国分离株的研究表明出现频率最高的是Arg­Arg­Phe­Arg­Arg，其次是His­Arg­Arg­Arg­Arg[6]。

1.3　IBV S1基因高变区和保守区以及它们与可能受体结合部位的关系

IBV中和血清特异性决定簇与已经确定的3个HVRs有关，分别是38位～67位的HVRⅠ，91位～141位的HVRⅡ及274位～387位的HVRⅢ。且这3个区域进化迅速，规律性需要更多的资料支持[8­9]。Ignjatovic J等[10]对澳大利亚分离株S蛋白及N蛋白上保守区及即使存在差异但有交叉保护能力的区域进行了分析，表明所有的S1及S2均具有抗原性，能被特异抗血清识别，也能在接种鸡后诱导抗体反应。而S1上的相对保守区及交叉保护区集中于194位～228位，245位～260位，294位～316位，518位～537位氨基酸。这些区域是否存在IBV的受体结合区域有待进一步查明。

2　IBV受体

病毒进入细胞的第一步是吸附，这是病毒与细胞以静电引力相结合，存在特异性和非特异性两种；第二步就是不可逆的病毒蛋白与细胞膜表面特定蛋白(受体)特异性结合。细胞表面有无病毒受体直接影响是否对该病毒具有易感性[11]。IBV感染细胞时，首先必须与宿主细胞表面受体结合。这是特定结构蛋白的空间构象与受体之间生化意义上的配对，从而决定了病毒的组织和细胞特异嗜性[12]。

IBV囊膜上的纤突蛋白(S)是宿主组织和细胞嗜性及致病性的主要决定因素，S1与宿主细胞膜上的细胞受体相结合，在S2的作用下病毒囊膜与宿主细胞膜融合，IBV与受体结合之后于中性或微碱性pH时发生构象改变[13]。从而获得病毒进入宿主细胞的能力。尽管不同的毒株之间存在微妙差别，但它们在受体利用上仍保留了进化相似性的轨迹。受体利用在冠状病毒几个群及属之间一致性很少，冠状病毒似乎可以采用多种策略便于与宿主受体结合从而与靶细胞发生相互作用。作为冠状病毒的IBV进入细胞也必然通过受体，目前多项研究分别得出了不同结论，主要认为氨肽酶N、唾液酸、硫酸乙酰肝素可作为IBV的功能性受体。这些成分究竟是特异受体或者只是黏附分子还不太确定。

2.1　氨肽酶N

氨肽酶N(APN)也叫CD13，是一种Ⅱ型金属蛋白酶，一种突出于细胞表面的二聚体。主要分布于肾、小肠、呼吸道上皮细胞、粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞、血脑屏障处的脑外膜细胞以及中枢神经系统突触膜等处。APN是许多Ⅰ型冠状病毒的细胞受体，如猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCoV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猫冠状病毒(FCoV)、犬冠状病毒(CCoV)及人冠状病毒(HCoV­229E)等的受体。一般来说，APN的同源物的受体活动在不同宿主之间不可互换。hAPN不能作为TGEV的受体，同样pAPN也不能作为HCoV­229E的受体。然而，fAPN不仅可作为FIPV的受体，还可作为CCoV、TGEV及HCoV­229E的受体。这种对比性质已经在一些研究中进行了细致分析，种属特异性或非特异性的功能结构通过构建嵌合体进行分析，然而嵌合体的构建并未显露单一的受体结合线性决定簇，而是在分子的两个不同区域可在确定的冠状病毒影响受体活动[6]。

然而，虽然禽类组织中可以分离到多种氨肽酶成分，禽类的APN成分至今仍然没有得到确定，认为最有可能是APN的是日本人Eiji Ichishima等从鸡卵黄中分离到的一种氨肽酶成分，他们将之命名为氨肽酶Ey。这种氨肽酶Ey成分被发现具有高度糖基化，相对分子质量约为150 ku，而包括唾液酸在内的糖类约占14%。其物理性质与人APN具有明显的相似性。一些文献中认为其就是禽类APN[14]。Sihn G等[15]正是利用氨肽酶Ey的全序列设计的一段引物对鸡胚胚胎发育中氨肽酶Ey的作用进行了PCR扩增，证明氨肽酶Ey在鸡胚胚胎发育过程中发挥着重要作用，研究氨肽酶Ey与鸡胚易于复制IBV的相关性很有意义。

Miguel B等[16]发现IBV能轻微感染猫细胞，IBV Ark­99株可在猫肾细胞系(FEK)上复制，将子代病毒转移到鸡胚后出现了IBV典型的鸡胚变化特点，将fAPN转染至非易感的BHK­21细胞后发现病毒可在胞浆内复制，表明fAPN似乎可以作为IBV的受体，不管这种成分在鸡组织分布情况如何，表明猫在IBV的传播上发挥着一定的作用。

然而，在2007年，Chu V C等[17]用瞬时转染及组型表达表明，fAPN不可能是IBV的功能型受体，他们发现fAPN的表达改变IBV多种毒株包括Ark­99对BHK­21细胞的易感性的能力非常微弱。之前的那种结论从何而来？如何解释这种现象呢？为什么同样的毒株及细胞会产生完全相反的结论？

如何解释这两种差异？难道前者的研究正如后者所说的是一种特例？而且鸡APN是否可以作为IBV的可能性受体呢？近年没有关于这方面的报道。由于IBV相对狭窄的宿主嗜性，似乎可能利用禽类特有的细胞表面蛋白作为其功能性受体，究竟何种蛋白发挥作用需要进一步探索。曾祥伟[18]曾经检测过鸡体内cAPN于不同组织器官的mRNA表达量以及同源差异，结果与IBV在对不同组织器官的嗜性相吻合，是否IBV就是利用cAPN作为功能性受体还有待进一步确证。

2.2　唾液酸

唾液酸(sialic acid)可作为多种病毒的特异受体或黏附因子。近年来发现流感病毒[19]、副黏病毒[20]、马鼻炎A病毒[21]等可利用相同或不同的唾液酸成分作为自身受体。

多种冠状病毒成员能与唾液酸发生相互作用。许多Ⅱ型冠状病毒与细胞表面成分中的N­乙酰基­9­乙酰神经氨酸的结合对于启动感染是必要的，受体破坏酶乙酰酯酶破坏了各自的唾液酸糖结合物从而便于病毒感染的传播。作为Ⅰ型冠状病毒成员的TGEV的感染中的致病性也与唾液酸的结合有关，PRCoV由于失去了与唾液酸的结合能力而失去了感染胃肠的能力。IBV不存在受体破坏酶，但鸡表面存在的N­乙酰神经氨酸似乎与病毒感染存在一定的关系。缺乏唾液酸结合能力的TGEV不能凝集红细胞，在细胞培养中可利用pAPN作为受体。TGEV的红细胞结合能力与Neu5Gc有关，对TGEV用神经氨酸酶处理后与红细胞结合能力下降。两种猪冠状病毒TGEV与PRCoV分别用NA处理后，TGEV明显对这种处理敏感。这说明唾液酸的结合活动有利于细胞结合但不足以使得细胞获得感染，表明唾液酸可能是黏附的重要因子也可能是一种重要的致病因子。TGEV与IBV在这方面存在一定的相似性，一些IBV株能凝集红细胞，在预先处理神经氨酸酶之后才能凝集，这是因为IBV优先识别α­2,3唾液数，但唾液酸的结合活动对于IBV的致病作用仍然不明[22]。

Winter C等[23]分析了唾液酸对于IBV感染的重要性。经神经氨酸酶处理过的Vero、BHK­21、CK细胞对原先易感的IBV Beau株变得抵制，IBV感染的唾液酸依赖性在IBV­M41上也存在着同样的结果。与流感病毒C以及仙台病毒相比，IBV对NA的处理更为敏感，这表明IBV的感染比其他病毒更需要唾液酸以启动感染。研究发现，IBV的感染与唾液酸的表达的α­2,3糖苷键有关，试验中霍乱弧菌产物NA的处理Vero、BHK­21细胞后感染明显减少，并且存在明显的剂量决定性。说明IBV的感染存在唾液酸依赖性融合，但亲和力较低，这种黏附促进成功感染，但还需要进一步结合以保证后来病毒与宿主细胞膜的融合，这意味着可能还需要一种特异性表面蛋白的存在。还说明可能由于Beau株能识别Vero、BHK­21等细胞表面的替代受体而获得感染。之后，Winter C等[24]又证实了唾液酸在IBV感染气管环培养中的作用，体外试验均证实了唾液酸在IBV感染细胞中作为初始黏附的重要作用，进一步研究唾液酸在IBV感染机体组织中的作用将是研究唾液酸对于IBV感染细胞作用将是重要课题。

Gambaryan A等[25]比较了鸡和鸭靶细胞上流感病毒的不同受体，表明两者体内不同的唾液酸的表达决定了不同来源的流感病毒对鸡和鸭分别代表的陆禽和水禽的致病能力的差异。鸡含有α­2,6半乳糖及α­2,3半乳糖两种唾液酸，鸭只含有α­2,3半乳糖，人只含有α­2,6半乳糖，这似乎表明来源于水禽的流感病毒可以感染陆禽，再在鸡体内经过选择获得结合α­2,6半乳糖的能力，从而使病毒跃迁至人。同样IBV能识别α­2,3半乳糖，这种唾液酸鸡体内存在而鸭没有，解释了IBV不感染水禽的原因。可能由于鸡体内α­2,3半乳糖表达能力有限，与IBV结合的亲和力较低。但留下一个问题，如果确实符合这种假设，唾液酸是黏附的重要因素，IBV就可能与人细胞黏附，如果IBV能变异得利用人的某种受体，那么IBV就有可能跃迁到人，是否应该警惕呢？

2.3　硫酸乙酰肝素

IBV Beau株是一株非常适合试验的毒株，主要是由于它具有在许多细胞中繁殖的能力，对鸡无致病性，鸡胚高度适应性以及不能凝集红细胞等特性。Beau与M41的S1同源率很高，在性质上差异很大。Beau株这种特异现象从何而来呢？

多种病毒在细胞连续传代的过程中产生的变异体，获得了与硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)的结合能力，可以感染非自身宿主细胞。如辛德毕斯病毒[26­27]，作为冠状病毒的鼠肝炎病毒也在细胞培养中获得了这一能力[28]。同样是冠状病毒的IBV是否也存在着这一现象呢？

Madu I G等[29]分析表明，硫酸乙酰肝素是Beau株的一种可能性黏附因子，他们用RT­PCR分析了Beau与其他IBV株S基因的差异，发现Beau株S2段 686位～691位存在着一个与其他株明显区别的恒定区SRRK(R)S。他们还运用可溶性肝素竞争试验表明，肝素的处理有效抑制了Beau株的感染，而对M41无任何作用，从而得出了HS是Beau株的一种特异性黏附因子的结论。是否这种特异性黏附作用决定了Beau的特性，与S2上特定区域的稳定性存在什么关系，需要进一步研究。S2区域作用于病毒与受体结合之后病毒与宿主细胞的融合，而特异黏附因子作用于受体结合之前，存在什么关系似乎需要更多的详细论证。

3　问题

由于IBV在进化关系上处于Ⅰ型及Ⅱ型冠状病毒之间，至今IBV的受体尚未能得到公认，氨肽酶N和唾液酸分别是Ⅰ型及Ⅱ型冠状病毒的受体及黏附因子，它们在IBV入侵细胞中发挥的功能需要进一步阐明。至于硫酸乙酰肝素似乎只是Beau株在异源细胞培养中特有的黏附因子。究竟哪一种成分在体内病毒入侵时发挥主要作用，与环境温度、湿度、空气等因素有没有关系，仍然需要进一步研究。