摘 要：贝类动物细胞免疫主要通过细胞的吞噬作用完成。溶酶体酶、凝集素、抗菌肽等体液免疫因子以杀菌、促进吞噬等方式参与贝类的免疫防御，阿片样活性肽、细胞因子、细胞激酶等是贝类免疫通信中的化学递质。化学递质通过介导免疫信号传导参与贝类的免疫防御，也是近年贝类的免疫研究的新热点。贝类生活环境中的各种因子能显著改变贝类的免疫机能，贝类对生态因子的敏感性使贝类的生态学研究成为人类等高等动物的生态免疫学研究模式。现代养殖业通过基因工程技术的手段来提高贝类的免疫力以适应养殖业的发展。
关键词：贝类；免疫机制；细胞免疫；体液免疫；化学递质
全面阐释贝类的免疫机制和免疫生态学机制，对于贝类自身抗病能力的提高和高等动物的免疫生态学研究都有重要的理论意义和实际意义。贝类的免疫学研究已有百余年的历史，最早可以追溯到Haeckel的工作，20世纪50年代Stauber等对于美洲牡蛎(Crassostreavirginica)体内颗粒细胞和可溶性的外源物质变化的观察，也是具有里程碑意义的研究。目前，贝类免疫学研究已经从贝类血细胞结构和功能的研究，体液免疫因子的发现和分离，进入到探索化学递质介导的免疫信号传导和各种免疫因子相互作用的阶段。本文对贝类的免疫机制研究进行综述。
1 贝类的细胞免疫
1.1 血细胞的分类
贝类的血细胞是贝类免疫的基础，不同种类的血细胞在细胞免疫的过程中具有不同的功能，明确不同细胞的功能是其中的关键。贝类血细胞的主要分类方法和技术有以下几种，早期ChengT C等[1]应用化学染色技术，将美国东部牡蛎(Crassostrea virginica)和硬壳蛤(Mercenariamercenria)的血细胞分为颗粒细胞、透明细胞和纤维细胞。NakayamaK等[2]运用光学显微镜和电子显微镜技术，在黄砗磲(Tridacnacrocea)中观察到了酸性粒细胞、无颗粒细胞和桑葚样细胞，同时发现，它们在细胞吞噬和细胞凝集中具有不同的作用。RussellP等[3]将贝类血细胞分为大的伸展细胞(呈酯酶和酸性磷酸酶阳性)，球形细胞 (细胞器少)，圆形细胞(胞质充满颗粒性物质的泡)，这种分类应用了光镜、电镜和酶细胞化学等多种方法。流式细胞技术是贝类细胞分类中的一种先进的方法，刘东武等[4]采用流式细胞技术，将中国蛤蜊(Mactrachinensis)和紫石房蛤(Saxudomuspurpuratus)两种贝类的血细胞分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞。许秀芹等[5]也运用流式细胞仪对多种贝的血细胞进行分类，大体分为颗粒细胞和透明细胞。其他的技术，如免疫探针、单克隆抗体技术等技术也运用到了贝类的血细胞分类中。
由于研究方法、贝的种类和贝的血细胞发育阶段的不同，贝类血细胞的分类没有统一的标准。目前，普遍把贝类的血细胞分为颗粒细胞和透明细胞两大类。可以展望在以后的研究中，以血细胞表面受体特征为依据，运用其他多种生物技术找到不同功能的细胞将是细胞分类研究的一个方向。
1.2 吞噬作用
贝类的细胞免疫主要通过吞噬作用完成。入侵贝类体内的病原体，如原虫、细菌、真菌、生物大分子和自身的坏死细胞、细胞碎片都通过血细胞吞噬作用消除，整个过程大致可以分为趋化、黏附、识别、内吞和消化杀死几个阶段。吞噬作用的基础是免疫识别，血细胞对异物的消除速率取决于细胞表面特征。当然，血细胞的吞噬能力还受到体液因子和外界条件的影响，如受到抗原的刺激时，贝类就表现出炎症反应和吞噬反应[1]。不同的血细胞在吞噬中的作用也不一样，颗粒细胞是主要的吞噬细胞，有很高的吞噬能力。
杀伤内吞进贝类体内异物的途径之一是由多种活性氧中间体(reactive oxygenintermediates，ROIs)完成的。ROIs伴随吞噬作用中的呼吸爆发(Respiratoryburst)过程，由细胞膜上的高铁细胞色素氧化还原酶产生。产生的ROIs包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和超卤化物(Hypohalides)等[6]。Nakamura等[7]在静止和刺激状态的扇贝中都检测到了超氧化氢的产生。O与NO结合产生的硝酸盐超氧化物阴离子 (peroxynitriteanion)是一种稳定的、高毒性的ROIs类物质，其有效灭菌活性使其成为最重要的一种活性氧中间物[8]。ROIs的氧化对宿主和病原体都有伤害，贝类体内ROIs的消除需要超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)的参与。在氧化过程中，机体蛋白的变性会诱导贝类和入侵的病原体体内产生热激蛋白(heat shockproteins，HSPs)。HSPs会诱导贝类体内大量蛋白类物质的折叠和生成，这些物质释放到体液中，会促进吞噬作用和提高贝类面对环境胁迫时的免疫力[9]。溶酶体释放的各种水解酶是杀伤外来物的另外一种机制。除了直接参与贝类细胞免疫外，溶酶体酶还能作为调理素有效调节吞噬作用。由此可以发现，贝类体内的防御系统是一个有效的整体，各种免疫因子存在复杂的相互作用。
1.3 其他细胞免疫方式
除吞噬作用外，贝类血细胞还在包囊作用、炎症反应、伤口修复等防御过程中发挥作用。包囊作用，即贝类血细胞在吞噬比自己大的物质时的一种特殊吞噬方式。在这种防御方式中，血细胞会动员自己全部的膜面积在异物表面完全伸展、扁平化，最后由若干吞噬细胞形成连续的细胞层而将异物包裹起来[1]，然后进行降解消除。在研究珍珠贝的伤口修复中，SuzukiT等[10]发现，无颗粒细胞发挥关键作用，它能清理组织碎片，阻止血液继续外流。同时，其分泌的细胞外基质是上皮细胞再生的模板。贝类血细胞直接参与贝类的免疫防御，其血细胞数能成为贝类免疫水平评估的重要参数。
2 体液免疫
在贝类的免疫系统中，除了细胞免疫方式外，血淋巴中的溶酶体酶、凝集素、非特异性抗菌肽等体液因子也发挥重要的防御作用。细胞免疫和体液免疫协同作用，共同抵抗外来物质的入侵。
2.1 溶酶体酶
溶酶体酶主要有酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)、β葡萄糖甘酸酶(βglucuronidase)、脂肪酶(lipase)、氨肽酶(aminopeptidase)、溶菌酶(lysozyme，LSZ)等，这些酶主要存在于颗粒细胞的溶酶体中，在细胞吞噬作用中，通过脱颗粒作用释放到血清中发挥作用[11]。其中，溶菌酶是溶酶体中一种最重要的酶，通过溶解杀伤细菌的方式起滤食海水细菌，防御病害的作用。其他的酶，如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶等既能直接起抗菌作用，又能作为调节因子影响细胞的吞噬。另外，溶酶体中的脂肪酶、氨基肽酶等水解酶还能消化脂肪和蛋白质，使溶酶体兼有消化和防御的功能。
2.2 凝集素
凝集素是一种非特异性免疫的蛋白质或糖蛋白，具有凝集细胞、抑制病原微生物等多种生物活性。在多种贝类的组织中，都发现了凝集素的存在[12]。凝集素的基本功能是通过免疫识别作用实现的，即凝集素表面携带的特异性糖基决定簇的受体能根据不同颗粒表面的糖基来识别异己。凝集素的识别作用能促进吞噬作用而具有调理素的功能。凝集素具有的特异性地识别细胞表面糖残基的功能，能被不同的糖类抑制，表明在泥蚶(TegillarcagranosaLinnaeus)凝集素的活性能被乳糖和半乳糖抑制[13]。凝集素的活性还受到环境因子的影响，因为环境中的pH和离子浓度改变了结合位点的构象，从而影响凝集素与受体的结合。研究证实，美洲巨蛎等多数软体动物的凝集素在pH6～7时才表现较强活力[14]。
2.3 抗菌肽
抗菌肽是动物体内一类具有广谱抗菌活性的肽的总称。在贝类中，抗菌肽的研究主要集中在贻贝，在病原刺激时，抗菌肽的迅速表达和全身分布使抗菌肽成为贝类体液防御中第一道重要防线。根据其化学性质的不同，MittaG等[15]把从贻贝中分离纯化的抗菌肽分为防御素、贻贝素、贻贝肽和贻贝霉素。抗菌肽主要以活跃的形式存在于颗粒细胞中，当受到病原微生物入侵时，分泌到细胞表面，直接起抗菌作用。防御素是当前抗菌肽中研究最多的一种，具有杀伤微生物细胞和生长旺盛的癌细胞的功能。已经分离纯化的防御素是一类具有小分子质量、阳离子、富含半胱氨酸，同时又有特定抗菌活性的一类抗菌肽。根据阐明的结构，分离纯化的防御素又可以分为贻贝防御素、Myticins、Mytilins和Mytinycin[12]。这些防御素在不同的贻贝中起特定的抗菌功能。
3 化学递质
化学递质是一类在免疫细胞之间和神经内分泌系统与免疫系统之间介导免疫应答的物质，具有调节机体生长、发育和神经活动等功能。在贝类的免疫研究中，化学递质作为一个新的领域正引起越来越多的关注。贝类的化学递质存在于贝类的体液和血细胞中，包括促肾上腺皮质素释放素(corticotropinreleasinghormone)、糖皮质素(glucocorticoids)、细胞因子(cytokines)、阿片样活性肽(opioidpeptides)和蛋白激酶(proteinkinase，PK)等化学活性物质[8]。阿片样活性肽通过改变免疫细胞的形态来参与贝类免疫。Hughes TK等[16]向贻贝的血淋巴加阿片肽时发现，免疫细胞变扁，产生趋化性，促进了吞噬作用。不同浓度的阿片样肽对贝类免疫的作用不一样。陈振英等[17]证实，一定浓度阿片样活性肽对贝类免疫防御系统具有负面效应，当血细胞中加入脑啡肽(5μg/mL～50μg/mL)后，血细胞的吞噬能力和包囊化能力都降低，脑啡肽含量越高，血细胞的吞噬能力和包囊化能力越低。阿片样活性肽通过免疫细胞表面的受体介导免疫信号的传导而影响免疫系统，贝类阿片样活性肽受体与高等动物一样，有μ、δ和κ3种受体。CadetP等利用反转录PCR和免疫探针技术分析了μ受体的mRNA在贻贝足神经节的表达。阿片样肽通过受体作用的方式使其作用效果受到受体数量和体液中的各种调理素的影响。
细胞因子是另外一种重要化学递质，在动物体内影响细胞增殖、分化、凋亡和死亡多种作用。在贝类的免疫系统中，细胞因子通过激活不同的信号转导通路，具有改变免疫细胞的迁移速率和提高诱导型氮氧化物合酶(induciblenitric oxide synthase，iNOS)的表达等作用。StefanoG等[19]在研究贝类免疫的过程中发现，白介素1(interleukin1，IL1)和肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factorα，TNFα)能影响血细胞的迁移。在细胞吞噬过程中，NovasA等[20]发现人的细胞因子IL2能诱导紫贻贝血细胞中一氧化氮(nitricoxide，NO)的产生。NO产生的活性氧中间物质能有效杀灭入侵病原菌，促进吞噬作用。
免疫细胞膜上的蛋白激酶是信号传导的重要分子，激酶传导信号受阻或传导方式的改变，都会对贝类免疫机能产生较大影响。丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated proteinkinase，MAPK)是其中重要的一种。试验表明，大肠埃希菌感染时，如果贻贝的P38MAPK受到抑制，则其抗菌活性将大大下降[21]。激酶的产生和活性都受到环境因子的影响，贝类血细胞受到环境中的佛波脂(phorbolester)的诱导，膜上能产生新的蛋白激酶p105[22]，这种激酶能分化出大量其他激酶，从而影响贝类的免疫信号传导，最终影响贝类的免疫能力。在贝类免疫中，化学递质的重要作用引起了越来越多的关注，但不同化学递质对下游免疫信号转导的影响以及递质作用效果和生态因子之间的关系还不明确。化学递质作用途径和彼此之间关系的研究对于明确贝类的免疫机理和提高贝类的免疫力都有重要的意义。
4 贝类免疫的改变
研究包括温度、氧浓度、氨氮、盐度和pH等环境因子和原生生物、微生物等生物因子的改变对贝类免疫力影响的学科称为贝类的生态免疫学(ecologicalimmunology)。环境因子对贝类免疫系统中的细胞免疫和体液免疫都会造成影响。MonariM等[23]研究证实，当水环境中的温度急剧或缓慢升高时，贝类的血细胞浓度升高而吞噬活性下降。温度对细胞免疫的改变可能是通过改变细胞表面的受体实现的。张鹭等[24]研究认为，降低盐度，缢蛏(SinonovaculacomstricataLamarck)血淋巴中包括磷脂酶A2、锌指蛋白的六种蛋白发生相应变化，引起缢蛏的死亡率显著增加。生物因子对贝类免疫的改变也是显著的。王江勇等[25]的研究认为贝类体液中的ACP、AKP活力在病原菌的入侵后显著升高，这种变化可能是贝类血细胞的破坏造成溶酶体的释放。贝类非特异性免疫的机制简单，对生活环境中各种因子的改变高度敏感。因此，贝类的免疫生态学研究往往成为一种模式，这种模式为理解人类等其他高等动物的生态免疫作用方式提供参考。
现代养殖利用葡聚糖，细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等免疫增强剂来提高贝类的免疫机能。徐大伦等[26]用不同浓度的浒苔多糖对华贵栉孔扇进行诱导，试验结果表明，华贵栉孔扇贝血淋巴中SOD酶和溶菌酶活性显著升高，整体免疫活力增强。其他运用到贝类养殖中的免疫增强剂，如：植物提取物、营养因子也可以提高贝类抗病力。利用基因工程技术来提高贝类的免疫能力是提高贝类免疫能力的一个新的方向。运用表达序列标签技术，SongL S等[27]克隆了栉孔扇贝的硒结合蛋白的cDNA。
5 展望
在体液免疫和细胞免疫两个大的方面，贝类的免疫研究已经做过很多工作，并有了比较全面的了解。但体液免疫和细胞免疫之间的协同关系和在这种相互作用中不同细胞的协作机制还不十分明确。化学递质在贝类免疫细胞之间、免疫系统和其他系统之间的桥梁作用对于理解贝类各种免疫因子的关系和它们之间的协作机制提供了新的视角。贝类的生态学免疫的简单模式对于了解人的免疫疾病的产生机理有着重要意义。利用分子生物学分离、重组、转移各种贝类抗病、抗逆基因，或者直接注射基因疫苗来提高贝的免疫力将是这方面研究的一个新的方向。