摘 要：灭活疫苗仍然是当前口蹄疫免疫控制的主要疫苗，研制口蹄疫灭活疫苗具有重要的现实意义，其研制方法在不断丰富和完善。文章详细描述了口蹄疫灭活疫苗研制的重要步骤及其进展，包括毒株筛选，病毒生产、灭活、抗原浓缩、纯化和配苗及疫苗的质量控制。制苗毒株的选择是研制疫苗的首要问题，直接关系到疫苗的免疫效果；病毒灭活和随后的安全试验是在制备灭活FMD疫苗中最关键的步骤；抗原浓缩纯化和配苗是保证疫苗良好免疫效果的必需。最后阐述了口蹄疫灭活疫苗在口蹄疫防控中的作用。
关键词：口蹄疫；灭活疫苗；研制；质量控制；作用
口蹄疫(Foot-and-mouth disease， FMD) 是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病。口蹄疫病原是口蹄疫病毒，属微核糖核酸病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthavirus)，有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia1型7个血清型，每个血清型又包含若干个亚型。该病毒不仅在各型间没有交叉免疫性，同血清型的各亚型之间也仅有部分交叉免疫性[1]。
各国家对FMD控制政策的选择依赖于自身的FMD状况及其传入的危险性。许多国家的FMD呈地方性流行或大流行趋势，此时采取扑灭政策是不现实的。采用疫苗接种来限制疫病的流行则更有效。从FMD疫苗的整个研究和应用情况看，活毒疫苗由于其自身固有的缺陷，已经被世界上许多国家摒弃；新型疫苗虽然取得一些非常有前途的结果，但在免疫效力和经济上目前难与常规疫苗竞争。常规灭活疫苗仍然是当前FMD免疫控制采用的主要疫苗。
1 FMD灭活疫苗的历史背景
1925年，Vallee等采集了FMDV感染牛的水疱液，经甲醛灭活，首次制成了FMD灭活疫苗。1926年－1929年，Belin及其同事首次用FMD发病牛舌皮组织病料制造FMD甲醛灭活苗。FMDV经甲醛灭活后，可以保持大部分免疫原性，但是，这些疫苗制造技术由于存在难以稳定生产、无法控制病毒扩散以及其安全性和免疫效力不确定等诸多弊端，在实践中应用时间不长。1934年Schmidt和Hansen发现了无毒性且能增强免疫效力的氢氧化铝胶佐剂。1938年Waldmann和Kobe结合上述两种方法，将FMDV接种于屠宰前健康牛舌皮内增殖病毒，待其发病后，取病牛舌部水疱皮和水疱液作为制苗病毒，加入氢氧化铝胶进行吸附，然后进一步用甲醛灭活，从而获得了符合实践要求的第一个FMD疫苗——铝胶甲醛灭活疫苗，当时将这种疫苗称为Waldmann疫苗或Schmidt-Waldmann疫苗[2]。1935年荷兰学者Frenkel用离体培养牛、羊、猪的胚胎皮肤，采用鸡血浆固定组织块的组织培养方法来培养FMDV获得成功。1947年－1954年，Frenkel又用牛舌上皮细胞培养法发展了自己创造的组织块Frenkel培养法，并用其增殖FMDV，使大规模病毒抗原生产技术获得成功。Frenkel疫苗在欧洲FMD的免疫防控上起到了重要作用。1952年Dulbecco首先用胰蛋白酶消化动物的肾脏皮质获得初代单层肾上皮细胞，用其培养FMDV获得成功。从1948年Sanford成功培育出第一个被称为L株(种系)细胞的传代细胞以来，各国兽医科学家相继用各种传代细胞系来培养FMDV，其中能获得满意滴度及病毒能稳定增殖的是PK-15细胞系、IB-RS-2细胞系和BHK-21细胞系。特别是自1962年BHK-2l细胞问世至今，它已成为制备FMD疫苗所需病毒抗原的理想细胞系，而广泛应用于FMD疫苗生产[3]。
2 FMD灭活疫苗研制
2.1 获取大量的病毒抗原
2.1.1 疫苗株筛选 在所有FMD灭活疫苗生产系统中，制苗毒株的选择是生产疫苗的首要问题。
曾经有一些观点认为，当地田间流行毒株应当用来制造有效的疫苗，但是由于许多流行毒株难以适应BHK-21细胞培养，不稳定或者适应后免疫原性会有所变化，即使适应细胞培养也需要一定的时间去试验和验证[4]，所以这种观点并不正确。选择的疫苗毒株必须要有良好的免疫原性及对田间流行毒株的抗原广谱性；其次要有良好的适应病毒培养系统及实验动物的复制能力和稳定性；另外，由于FMDV变异性强，为了保证有效的免疫效果，应定期检验疫苗毒株和流行毒株之间的抗原关系(r值)，并不定期地更新制苗毒株[5]。选定的制苗毒株需要通过连续传代适应单层细胞培养或悬浮细胞培养，但应尽可能减少传代次数，以防病毒发生抗原漂移。毒株经型、株鉴定，并确保无其他微生物污染后，加甘油－20℃保存或不加甘油于更低温度下保存。工作种毒从母源种毒进行数代扩增，使其感染性达到1 pfu/100细胞即可使用。
在南美洲的某些国家和地区，只允许选用由泛美口蹄疫中心(PANAFTOSA：Centro Panamericano de FiebreAftosa)推荐的疫苗毒株，例如O1 Lcampos已经成功应用了几十年。
2.1.2 病毒生产 应用于商品疫苗大规模生产FMDV抗原的技术有3种：①牛舌上皮组织生产的Frenkel培养法；②在转瓶单层BHK-21传代细胞上生产的单层培养法；③在发酵罐中BHK-21或IFFA8传代细胞上(后者仅在法国梅里厄病毒研究所应用)生产的悬浮培养法。这三个大规模病毒抗原生产系统，虽然各有利弊，但都能生产出高质量的病毒抗原用于疫苗制造。转瓶培养系统的核心是采用摇动或转动的圆筒培养容器，能使细胞交替接触培养液和空气，从而使传质和传热比固定培养要好，但是其表面积有限，单位体积所提供的细胞生长表面积小，细胞生长密度低；悬浮培养法是应用密闭的大容量发酵罐系统培养细胞，当细胞数增至3×106个/mL时，即可接种病毒，并于接毒后20h～30 h收毒，此时病毒滴度一般可达107～108 TCID50/mL[6]。
目前国际上以在发酵罐中BHK-21悬浮培养法生产病毒常用。所需的疫苗株被鉴定出来后，它们需要适应在BHK-21细胞悬浮培养中生长。然而，大部分FMDV对单层细胞的适应性比悬浮培养好得多。常用的方法是首先在BHK-21单层细胞上传代，当细胞能够快速(12h内)发生病变时，这些毒株可以进一步适应悬浮培养的细胞，直到病毒复制到最佳。
2.2 灭活
病毒灭活和随后的安全试验是制备灭活FMD疫苗中最关键的步骤。欧洲一些口蹄疫的暴发与疫苗接种有关，表明疫苗中的病毒不一定总是被很好的灭活。甲醛多年来一直被用于灭活病毒，但其缺点是灭活过程不符合一级动力学原理(firstorderkinetics)。病毒液中的水解乳蛋白和Tris缓冲液能抑制甲醛的活性。所以，到20世纪80年代，大多数疫苗生产商改用氮丙啶类(aziridine)灭活剂[7]，如AEI(N-acetylethyleneimine)，灭活曲线为线性，主要作用于核酸，蛋白免疫抗原保持较好，但毒性较大。也有用BEA(bromoethylaminehydrobromide)的，该灭活剂毒性稍小，作用同AEI(binaryethyleneimine)。后来Bahnemann等对BEA进行了改进，即为BEI，作用同AEI但毒性小，被广泛采用。2000年世界动物卫生组织(OIE)向各国推荐使用1 mmol/L BEI两次灭活法，即20 ℃～37℃灭活24 h后再加一次BEI，再灭活24 h的方法，此法已经过20多年的应用，证明其较好。2006年OIE又推荐3 mmol/LBEI两次灭活法，以26 ℃共灭活48 h[8]。BEI用量从1 mmol/L增加到3 mmol/L，灭活温度从30 ℃降至26℃，灭活剂用量的提高意味着疫苗的安全性会更好，温度的降低有利于保持病毒粒子146 S的完整性。
有研究表明，用aziridine灭活病毒与甲醛相比，不仅毒性大而且灭活的病毒稳定性差。用甲醛灭活的弗氏佐剂苗有效期可达10年，而BEI灭活的疫苗有效期不超过2年。甲醛的灭活稳定性可能与其交联性有关，不稳定的SAT2型用aziridine灭活后，再经甲醛处理，稳定性明显提高。而甲醛与BEI的协同作用可将灭活的效力提高100倍，缩短了灭活时间，既改善了疫苗的安全性，又保护了有效抗原146S完整性[9]。
2.3 抗原浓缩纯化
FMD灭活疫苗诱发有效的免疫应答，通常需要较大量的抗原，而疫苗中的非病毒蛋白可引起变态反应，另外，伴随病毒增殖而产生的病毒非结构蛋白对于感染动物的甄别亦带来困难。因此，在灭活疫苗特别是多价苗生产中，为了保证免疫效果，降低疫苗使用剂量，减少接种引起的有害反应，利于病毒抗原和成品苗的贮存，便于免疫和感染的鉴别，就必须对病毒抗原进行浓缩纯化。现在常用于大规模生产的纯化浓缩方法是超滤和PEG或聚乙烯氧化物(PEO)沉淀法，不仅可以达到理想的浓缩倍数，还可大大降低抗原收获物中非病毒蛋白成分及含量。
用超滤法浓缩FMDV制备品的开拓者是Strohmaier。目前，在生产中用切向流超滤装置或中空纤维过滤系统或震动筛进行浓缩[8]。然而，过滤材料的载流量小于等于100ku时纯化效果不好，而大于200 ku时146 S的损失又大[9]。
使用分子质量为6000(PEG6M)的PEG(聚乙二醇)纯化时，能够充分的去除来源于BHK疫苗中引起过敏反应的物质。沉淀的抗原用低速离心法获得，也可用助滤剂进行沉淀抗原的过滤，如钙化的硅藻土，比离心法方便的多[10]。灭活抗原也能用PEO沉淀法有效的沉淀。PEG沉淀可充分除去变应原成分，PEO可使FMDV浓缩达1000倍，从病毒收获物中最少除去95%的杂蛋白质。
2.4 乳化和配苗
为提高FMD灭活疫苗的免疫效果，需要将灭活的抗原收获物与佐剂混合以增强免疫应答。主要有3种佐剂用于FMD疫苗，分别是氢氧化铝胶(Al(OH)3-gel)、皂苷和不同类型的油乳胶。前两种类型的佐剂一般被称为液体疫苗。
最普遍的牛用疫苗是氢氧化铝胶吸附病毒抗原制备的，其中氢氧化铝胶为佐剂，其他成分还有消泡剂、酚红(如果疫苗使用者需要)、水解乳蛋白、蛋白胨磷酸培养基、抗菌素、氨基酸、维生素和盐，另外还加皂素作为另一种佐剂以及硫柳汞/氯仿等防腐剂。氢氧化铝胶和皂素佐剂用于常规疫苗，早已证实了对牛的免疫效力，但对猪的免疫效力低的多。
另一种剂型的疫苗是以矿物油为佐剂的油苗，油佐剂疫苗优于传统的氢氧化铝胶皂素疫苗，不仅可以用于猪的免疫预防，而且免疫持续期也比较长，所以在南美和中国也广泛用于免疫牛的疫苗配制。一般预先将乳化剂(如单油酸甘露糖醇)和矿物油混合，再加入等体积水相抗原，经胶体磨或连续机械性或流动性超声乳化机乳化而成。如果再加入含有少量吐温-80的水相抗原进行乳化，就能降低疫苗的黏稠度[11]，制成较复杂的双相乳剂疫苗(水/油/水)。目前认为双相油佐剂疫苗效果最好，能够用于所有的动物。而MontanideISA206和ISA205的利用大大简化了疫苗的配制[12]。
近年来，“即用型”油佐剂的研究取得了很大的进展，例如，含十八烯酸酯和2,5-甘露糖醇酐的油可以乳化成既稳定黏度又小的双相乳剂，而且不需要超声乳化设备[13]。
2.5 灭活疫苗的质量控制
由于灭活疫苗在防控FMD上的成效，许多国家把很多研究力量投入到新的和改进的灭活苗生产工艺上，对影响疫苗质量的因素及其控制进行了广泛深入的研究[14]。
2.5.1 生产控制 FMDV抗原和疫苗的生产必须完全遵守GMP标准，在严格无菌条件下进行。细胞培养、病毒增殖的最适温度应准确控制在37℃±1 ℃，灭活病毒的温度控制在30 ℃±1 ℃，其他生产阶段应将温度降到4 ℃～6℃。病毒增殖培养的pH应维持在7.6左右，绝不能低于7.0[15]。
FMDV很容易发生抗原漂移，为确保疫苗质量，应加强种毒管理。无论生产用毒种还是效检用毒种，都要建立完善的种子批制度。定期对母种、基础种子、工作种子进行理化特性、型特异性、免疫原性和毒力检测，并进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验。所有毒种均应用加50%甘油的PBS于－20℃以下保存。
2.5.2 中间检验 生产FMD疫苗所涉及的所有原材料，如血清、各种试剂等，都必须按照其相应的质量标准进行严格检测。
由于FMDV抗原的数量和质量直接影响疫苗效力，应通过灭活前病毒滴度或灭活后146 S颗粒含量测定，对生产的病毒液质量进行准确评估。
灭活完成后，每批灭活病毒抗原样品应通过敏感单层细胞传代或乳鼠接种试验，判定灭活病毒抗原的安全性。敏感单层细胞传代时，通常连续传2代～3代，应无CPE；样品接种乳鼠后，连续观察7日，应全部健活。欧洲药典规定[16]，FMDV灭活安全检测时，每1000 L灭活病毒抗原应取样6 mL