朊蛋白抗体研究与应用

朊病毒疾病是一组表现为散发性、家族性及传播性的中枢神经系统的慢性退行性疾病，是一种人兽共患的新型传染病，其致病因子是一种具有传染性的蛋白质，称之为朊蛋白(Prionprotein),简称PrP。细胞膜表面正常蛋白PrPc的构象改变、聚集并在脑组织沉积，是Prion疾病的作用机制。动物的Prion疾病除羊痒病（Scrapie）外，还包括传染性水貂脑病（TME），鹿慢性消耗性疾病（CWD），牛海绵状脑病（BSE）及猫海绵状脑病（FSE）；人的Prion疾病有克亚氏病（CJD），库鲁病（KURU）和格斯特曼综合征（GSS）和家族致死性失眠症(FFI)等。绵羊和山羊的痒病是Prion病的原型。这类疾病虽发生率很低，但预后不良；虽亚临床表现健康，但其携带的病原有传染给他人和后代的潜在危险。因此建立快速、准确的诊断方

法，对切断感染源，减少Prion疾病的传播十分必要。目前，在Prion疾病的诊断与防治中，国际上普遍采用特异性抗PrP抗体介导的免疫组化法和

免疫转印法。人和动物组织中的PrPc及PrPsc的检测均有赖于特异性抗体。因而，抗体在Prion疾病的研究中起着极为重要的作用。

1 研究现状 

国外许多实验室已研制成PrP抗体有抗鼠、抗羊、抗牛、抗仓鼠或人PrP的单抗或多抗，并广泛应用于人类和动物的Prion疾病研究中。目前，制备抗体的方式多是用完整的PrP蛋白免疫PrP基因缺失小鼠，或者用化学合成的PrP肽段与载体交联后，加佐剂增强PrPc的抗原性，免疫兔子。而后利用传统的杂交瘤技术或噬菌体表面展示技术筛选出特异性较高的克隆。较为成熟的制备PrP抗体的方法，大致可分以下5种。

1．1 人多肽PrP抗体根据人PrP序列，合成多肽与载体BSA偶联，免疫兔子，制备人Prion多肽抗体。此多抗可同时与人的PrPc和PrPsc反应，及鼠PrPc反应。



1．2以原核细胞表达的人PrP为抗原制备人PrP抗体将标准的人PrP转入原核表达载体pGEX2T，成功地利用体外方法表达了GST融合蛋白。用

所表达的蛋白免疫大白兔，制备了Prion特异的多抗。此多抗可与人、鼠的PrPc反应。

1．3单抗15B3的制备用全长的牛PrP免疫PrP基因敲除的小鼠，然后把免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，最后从杂交瘤细胞中筛选出单抗15B3。此单抗能够区分人、鼠及牛的PrPc和PrPsc，这不仅在人和其他动物Prion疾病的临床前活体检测上具有重要意义，而且在该病的治疗上也有潜在的应用前景。

1．4 鸡单抗的制备 用人或牛的Prion蛋白免疫鸡，制备单抗HUC213可用于诊断人及其他动物Prion疾病。

1．5 以核酸为基础制备PrP单抗把PrP的DNA或RNA直接注射到PrP基因敲除鼠肌肉组织内，产生的单抗可以有效识别不同动物的PrPc。PrPc和PrPsc分别是组织细胞的正常蛋白及异构体，要想得到针对PrP的单抗，必须克服机体对它的耐受。目前在已经获得的多种PrPc的单抗包括15B3，3F4，6H4，6H3，L42，F89等。这些单抗在人、牛、鼠及羊等物种间有交叉反应。而且，大部分抗体还不能区别PrP的两种异构体，只有单克隆抗体15B3能特异性识别PrPsc。

2 在诊断Prion疾病中的作用

Prion疾病的诊断方法很多，包括生物学测定法，组织病理学检查，PrPsc的免疫学检测（细胞免疫化学染色，免疫印印迹，组织印迹ELISA），以及痒病相关纤维检查和PrP基因分析。其中，对病死动物的脑组织进行组织病理学检查和在病死动物的脑组织提取液中检测这种异常的蛋白质(PrPsc)是确诊本病的方法。人和动物组织中的PrPc及PrPsc的检测均有赖于特异性抗体。

目前，国际上普遍采用诊断率较高的特异性抗PrP抗体介导的免疫组化法和免疫转印法。其中Westernblot试验是诊断Prion疾病的主要诊断方法，但其敏感性和特异性也受相应PrP抗体种类的影响。

2．1 用于PrPsc的检测

2．1．1 新鲜脑组织材料按一定试验程序，用蛋白酶Ｋ处理脑组织匀浆，电泳后转印到NC膜上，用抗PrP单抗或兔多抗进行免疫杂交后的染色印记斑点，当在2000～33 000蛋白带上显色时，可以此鉴别PrPsc。

2．1．2 固定脑组织材料在Prion疾病诊断中免疫组织化学法被认为是最可靠的诊断方法。免疫组化技术在福尔马林固定的脑组织切片中，先变性处理破坏PrPc，后采用硫氰酸胍、蒸汽高压等方法增强PrPsc免疫组化染色，然后用抗PrP抗体进行免疫组化，可检测PrPsc。

2．2 与Prion其他相关研究 实验表明在体内和体外，PrP特异性抗体均能清除PrPsc，这种清除作用呈剂量和时间依赖性。充分的抗体作用能彻底清除培养体系中的PrPsc,去除抗体后PrPsc不再重现，但抗体不能消除细胞对PrPsc的易感性。另外，有文章报道，认为PrPsc感染细胞后，可以转化正常的PrPc，同时其本身也被细胞吞噬降解，但这个过程远比转化正常的PrPc速度缓慢，从而造成PrPs

c的沉积。而抗体与PrPc或PrPsc结合，阻断PrPc向PrPsc的形成，使少量PrPsc得以降解。同时，由于PrP抗体与结合部位有关（比如，D18与6H4的作用位点分别位于132～156,144～152，这个区域被认为在PrP的构象转变过程中起重要的作用），因此，并非所有的抗体都对Prion有效。

此外，抗体还广泛应用于Prion蛋白的分子特性研究和Prion蛋白的细胞分布。

3 敏感性和特异性评价 

目前所用的PrP抗体有部分纯化的抗鼠、抗羊、抗牛、抗仓鼠或人PrP的单抗或多抗。其中抗人PrP单抗6H4针对144～152个氨基酸序列片段（在人、牛、羊、兔、水貂和许多灵长类动物中是高度保守的）；8G8、4F2分别是针对第95～110氨基酸序列和第79～92氨基酸序列的抗人PrP单抗，SAF15和SAF34是仓鼠PrP的抗体，其中SAF34是抗仓鼠PrP中的第79～92个氨基酸片段抗体；F89是绵羊PrP的抗体；DF7是鼠抗牛重组PrP中第140

～180位氨基酸的单抗；1A8和1B3是鼠PrP的单抗。

有文献报道,8G8,6H4,SAF34,SAF15和4F2均可检测到痒病羊脑组织中的PrPsc，但8G8,6H4,SAF34更敏感。而抗体DF7是牛和人PrP的特异性单抗，所以未能检测到羊脑组织中的PrP。此外，FH11是鼠抗重组绵羊PrP中第89～98位氨基酸片段的单抗,通常用于未经PK处理过的样品中PrP的检测，FH11可与绵羊、人、牛和仓鼠的PrP进行反应。

4 PrP抗体的治疗及预防作用

在脑组织沉积的PrPsc是Prion疾病的致病因子。因此，寻求PrPsc的降解和消

化是治疗与预防Prion疾病的有效途径。人们曾尝试通过多种途径来预防或治疗Prion疾病：抑制PrPc的表达或增强PrPsc对

酶的敏感性，从而通过酶解消除PrPsc。通过药物降解或消除PrPsc，阴离子染料刚果红是一种淀粉样蛋白结合染料，可以与P

rion淀粉样区的β折叠结合而阻止Prion作为模板的复制。Soto等构建的构建的β折叠阻

断肽药物和Chabry等构建的短肽，已初步显示出能抑制PrPsc对PrPc的诱变，而且

由于其序列的大多数种系中都是高度保守的，但不宜通过血脑屏障,限制了二者的应用。近年的研究表明，抗体在治疗及预防Prion疾病方面可能发挥巨大作用。抗体可与PrPc结合，增强了PrPc的稳定性或抗体与PrPsc结合,从而阻断PrPc向PrPsc的转化；因此，抗体的被动免疫或许可提供治疗Prion疾病的有效途径，显出很广阔的应用前景。

此外，对于Prion疾病自身免疫假说预测，受PrPsc感染的动物体内有升高的抗体，包括针对具有交叉反应性的自身抗原的细菌抗体和针对髓鞘质及宿主编码的Prion蛋白质序列的抗体，这些抗体的存在对于建立早期诊断方法是十分有用的。

5 结语



尽管PrP抗体在Prion疾病的研究中显示了极大的作用，但由于其存在着易降解的缺点，以及大部分抗体还不能区别PrP的两种异构体，单抗15B3虽能特异性地识别PrPsc，但该抗体针对的是构象表位，由于Prion存在着多种不同的构型，因而并非所有的抗体都对Prion有效。