摘要本文通过研究生物芯片的发展历史、类型、应用以及所依赖的技术，探讨了生物芯片的发展前景，尤其是在法医领域的应用前景。
关键词 生物芯片 遗传标记 克隆与杂交PCR 微量和荧光检测技术
0 引言
生物芯片技术是从80年代提出，近十年发展起来的应用于分子生物学研究的一项新技术，因具有与芯片相似的微型化和大规模分析、处理生物信息的特点而得名。在其发展过程中有不同的称谓，如Biochip、Genechip、DNAchip、Microarray等，反映了其研究对象的差异和制作工艺的发展。新技术的进展已使之能在一块或若干块芯片上完成从生物样品的分离、制备、生化反应的进行如PCR及对核酸产物的分离等诸多生物学过程，显示出快速、高效率、高通量地处理生物学信息的能力。
1 生物芯片技术的发展历史
生物芯片技术的发展最初得益于Ed Southern提出的核酸杂交理论，即标记的核酸分子能够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交。从这一角度而言，Southern blot可以被看作是生物芯片的雏形。稍后人们发明了以各种膜片为介质基础的克隆库扫描技术，它引入了克隆与杂交信号一一对应的概念。在此基础上，克隆库的分格筛选技术得到很好的应用。1989年，Ed Southern提出了利用在玻片表面固定的寡核苷酸探针杂交进行基因序列测定的实验设计。而真正使生物芯片技术发展并实用化得益于两项关键技术的发明。其一是非孔的固相支持介质如玻璃片的使用，它使得微量和荧光检测技术的实现成为可能。通过高精度的机械手和连续点样技术可将10000个cDNA样品均匀等距地点在一块常用的显微镜载玻片大小的玻片上，并与双色荧光标记的探针分子杂交，用激光共聚焦系统检测信号的强弱。其二是高密度原位合成寡核苷酸的方法。Steve Foder研究小组采用半导体制作技术中的光路印刷屏蔽技术生产高密度的寡核苷酸芯片。在仅20um2的玻片表面合成、固定达400000个寡核苷酸探针。其他还有采用微量喷印等方法进行原位合成寡核苷酸的技术尝试。缩微芯片又称为微型实验室芯片，是将常规进行的核酸提取、杂交、PER反应及电泳等分子生物学操作技术过程集中于一块或若干块作为生物样品分离、制备的玻片上来完成。
2 生物芯片的类型
2．1 DNA芯片
DNA芯片是利用原位合成法或将已合成好的一系列寡核苷酸以预先设定的排列方式固定在固相支持介质表面(硅片、玻片、尼龙膜等)，形成高密度的寡核苷酸的阵列，以用于杂交分析。其加工工艺有下面几种。
2．1．1 光指导的原位合成法
由美国A ffymetrix公司的Pease研究小组发明并取得专利。连接体的一端连接固相介质，另一端依靠羟基连接光保护基团，形成对羟基的保护，使之不能与加入的脱氧核糖核苷酸发生聚合反应。光通过一定的光栅遮板照射到介质表面特定的目标合成位置，发生涯保护反应，恢复功能的自由羟基可与5端连有感光保护基团的N-乙酰-脱氧核糖核苷酸发生聚合反应，反应物连到特定的目标位置上。然后，光通过第二块光栅，在新的特定位置上照射洼保护、连接、聚合。每一次反应，可将一种脱氧核苷酸连接到特定的位置。美国A ffymetrix公司制备的芯片可在1.28cm2的表面合成、固定300000种20～25bp的寡核苷酸探针。
2．1．2 化学喷射法
这项由Incyte Pharmaceutical公司首先研制并采用的方法原理是将DNA合成试剂按一定顺序逐层喷射到芯片指定位置，合成寡核苷酸来制作芯片的。
2．1．3 微流体通道合成法
其原理是在玻璃介质表面铰链一系列lmm硅胶管形成通道，DNA合成试剂被引入通道，通过变换微流体模板，可在玻片上合成不同序列的寡核苷酸探针。
2．1．4 分子印章法
其原理是通过光刻硅胶模板形成分子印章，涂覆DNA合成试剂，按一定顺序压印在基片的表面，合成不同的寡核苷酸探针。
2．1．5 机械点涂法
是通过高精密机械控制的枪头与芯片表面接触而将寡核苷酸定位点滴到特定位置。
2．2 微点阵
微点阵多指通过点样法制备的中、低密度点阵芯片。其所用介质一般是玻片、尼龙膜等，玻片需经特殊的处理，多是经多聚赖氨酸等进行包被或进行其他形式的化学修饰。用于点样的探针可以是cDNA片段、基因组片段、寡核苷酸或核酸类似物。由计算机控制的机械装置将已合成或分离、提纯的靶DNA分子点样于其上的不同分区，完成后风干，经一定剂量的紫外线照射使之与支持介质共价铰链固定或经化学铰链固定。其核酸样品的最小点样量可控制在0.25～lnl，点样斑点直径在100～150um之间，斑点间距200～250um。这套装置最初由斯坦福大学的Pat Brown小组研制成功，目前有多家公司生产、销售相应设备，主要差异表现在样品的处理能力上。
2．3 缩微芯片
2．3．1 生物样品的制备芯片
生物样品的芯片制备主要是指核酸(DNA、RNA)的制备分析。其制备过程通常要经过细胞分离、破胞、脱蛋白等步骤，最终得到纯度较高的DNA、RNA，并进行分析。目前，在细胞分离方法上有过滤分离(据大小差异分离)和介电电泳分离(利用在芯片上所施加的高频非均匀电场，诱导细胞产生不同的偶电极，导致细胞受不同的介电力的作用，而从样品中分离出来)等。芯片上破胞的方法有湿法蚀刻和反应离子蚀刻及等离子蚀刻等工艺在硅片上加工出5000个长200um、直径20um的细柱状结构用于DNA的萃取。
2．3．2 PCR芯片、毛细管电泳芯片及PCR毛细管电泳芯片
美国宾夕法尼亚大学研究小组是在硅一玻璃芯片上进行的PCR反应。通过化学蚀刻技术在载片表面加工出PCR的多个反应池和PCR产物分离的泳道，覆盖化学介质而形成封闭的反应体系。PE公司PCR则在塑料芯片上完成。美国宾西法尼亚大学的研究小组成功地用在坝式微过滤芯片中直接分离获得的人白细胞通过升温破胞后释放的DNA进行了PCR扩增反应，这是世界上首例将样品制备和扩增反应集成一体的研究成果。芯片毛细管电泳是1983年由美国的杜邦公司的Pace开发出来。首次用芯片毛细管电泳检测DNA突变和对DNA进行测序的工作是由美国加利福尼亚大学伯克利分校的Mathics研究小组完成的。通过在芯片上施加高压直流电，在近2分种的时间内完成了从118～1353bps的多个DNA片段的快速分离。此外，他们与劳伦斯一利物摩国家实验室Nothrup的研究小组合作，报道了首例将PCR反应与芯片毛细管电泳集成一体的多重PCR检测工作。Schmalzing等实现了45s在2.6cm长的芯片泳道上对SIR，包括CSF1PO，TPOX，TH01和vWA的快速分离。
目前，国外多个研究小组和公司正用此项技术进行遗传性疾病基因突变检测工作，已有成功的报道。如宾夕法尼亚大学的研究小组成功地用芯片扩增了用于诊断杜鑫一贝克肌萎缩的多个DNA片段，并进行了分离。
3 生物芯片的应用
DNA芯片技术的应用范围非常广泛，覆盖了与生命有关的几乎所有领域：在农业方面，应用于栽培技术和杀虫剂的改良；在化学方面，例如应用于大规模的无数活性分子的测试；此外涉及食品或环境技术方面的质量控制。
3．1 利用DNA芯片进行DNA序列的测定
芯片测序的原理不同于传统的Maxam和Gilbert的化学测序法及Sanger的末端终止法，其源于杂交测序。原理是任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一系列碱基数固定、交叉重叠的寡核苷酸。目前尚无商品化产品应用。
3．2 利用芯片技术进行基因突变的检测
方法有信号增强法、信号减弱法、短序列测定法，可用于大规模筛查由于基因突变所引发的疾病。在应用中证实这项技术具有高灵敏度、大规模化和高度自动化的优点 预计包括许多临床常见病病原体诊断的芯片诊断技术不久将在疾病的分子诊断方面得到广泛应用。
3．3 用于基因转录水平的监测、基因组分析和后基因组研究
采用芯片技术，利用杂交对基因表达情况进行分析的好处是仅用很少的细胞物质便能提供多个相关基因的表达信息，具有样品用量少，自动化程度高，被测目标DNA密度高的优点。芯片技术可应用于人类基因组研究中，以单核苷酸多态性(SNPs)为基因特异性的标记，用于检测与之相关联的基因间的差异，分析两个个体遗传物质的差异，对研究亲代与子代间遗传中的重组及绘制更为精确的遗传图谱有着重要的实用价值
4 前景与展望
芯片技术的迅速发展和应用已经引起各方面的广泛关注，但也受到一定的限制，表现在以下三个方面：(1)需要大量的已测知的、准确的DNA、cDNA片段的序列信息 充分利用这些信息才得以使芯片技术成为大规模、集成化、整体获取生物信息的有效手段。(2)需要高密度芯片制作的精密机械系统和操作工艺及杂交的微弱信号的检出装置，以保证芯片技术高灵敏度、微量分析的特点，并具可靠的可重复性。(3)需要具有对杂交信号及相关信息、数据的大规模处理和分析的能力，这主要是指对进行结果分析的计算机及其专业软件的要求。
许多公司可根据用户的需要定制各种芯片系统，为研究人员提供了极大的方便。国内目前已有清华大学、中国科学院、军事医学科学院和东南大学等多家单位正从事芯片技术的应用和研究性工作，可以预见芯片技术在不同领域的研究和应用将极大地推进生物学的发展。目前，开展法医DNA芯片研究，发挥DNA芯片同步检测大量DNA遗传标记的潜力，避免DNA芯片的假阳性率及假阴性率，解决DNA芯片与现有DNA遗传标记的兼容性问题是研究的重点。
