自Klemperer于1983年首次报道鸡蛋中存在抗体以来，进一步研究证明鸡蛋内的抗体主要存在于卵黄内，称为卵黄抗体（egg yolk immunoglobulins 简称IgY）。卵黄抗体以IgG占优势，而IgA和IgM的含量极低。近20年来国内外学者对卵黄抗体的制备和应用做了大量的研究。由于卵黄IgG的制备成本非常低，卵黄抗体已越来越广泛地用于许多疾病的防治。但是，用于生产卵黄抗体的鸡蛋多来自普通蛋鸡，用其制备的卵黄抗体可能带有某些卵传性病原，如禽脑脊髓炎、禽白血病、网状内皮组织增生症、减蛋综合征、支原体病等。使用这些卵黄抗体，甚至是精制的IgY进行疾病防治的同时，可能造成上述疾病的传播和扩散。本试验用3种低浓度的甲醛对混有禽脑脊髓炎病毒的禽流感-H9高免卵黄抗体在不同温度下，作用不同时间，进行灭活处理，以期建立一种对卵黄抗体的有效灭活方法。
1 材料与方法
1.1 禽脑脊髓炎病毒(AEV)Van Roekel标准毒株〓美国SPAFAS公司进口，经SPF鸡胚传代，EID50为10－6。－70℃保存备用。
1.2 禽流感-H9 N2标准毒株美国SPAFAS公司进口，经SPF鸡胚传代，EID50为10－6。－70℃保存备用。
1.3 SPF鸡蛋北京市实验动物中心提供。孵化成7日龄鸡胚备用。
1.4 禽流感-H9油佐剂灭活疫苗自制。
1.5 试验方法
1.5.1 卵黄抗体的制备 用禽流感-H9油佐剂灭活疫苗强化免疫300日龄宝万斯高兰种鸡，免疫程序为：每7天免疫1次，首免疫剂量为1 ml/只，以后每次增加0.5ml/只，连续免疫4次。当卵黄抗体效价达到210以上，收取卵黄。通过乙酸乙酸钠沉降脱脂，用半饱和硫酸铵盐析沉淀IgY，加含有200 IU(μg)青霉素、链霉素、pH为7.2的PBS稀释成较纯的禽流感-H9高免卵黄抗体溶液，效价为211。
1.5.2卵黄抗体的灭活将AEV和禽流感-H9的卵黄抗体溶液以1∶9的比例混合，采用3种不同甲醛浓度，在4℃或56℃条件下，作用不同时间进行灭活，详见表1。
1.5.3 卵黄抗体灭活效果的检验将上述不同灭活方法处理的AEV和卵黄抗体混合液，通过卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，每胚接种0.2 ml，每各处理组5枚。同时设两组对照，一组为含有双抗的肉汤10倍稀释的AEV，另一组为卵黄抗体液10倍稀释的AEV，同样卵黄囊各接种7日龄SPF鸡胚5枚。37℃孵化11天后，观察鸡胚的死亡情况和病理变化。
表1AEV、卵黄抗体混合液的灭活方法(略)
1.5.4灭活禽流感-H9卵黄抗体活性检验（雏鸡的攻毒保护试验）选用30日龄海兰褐雏鸡（禽流感-H9母源抗体为阴性）60只，按表2分组，每组10只。胸部皮下注射0.2 ml禽流感-H9N2攻毒，同时分别肌肉注射1 ml灭活卵黄抗体与未灭活的卵黄抗体，进行攻毒保护性试验。攻毒后连续观察2周，记录攻毒鸡的精神状态、采食和发病情况。
表2雏鸡攻毒保护试验分组情况(略)
1.5.5 攻毒雏鸡的病毒分离攻毒后第7天采集各组雏鸡的肛拭子，将其浸泡在含2 000 IU(μg)双抗的生理盐水中，4℃作用2 h，取其上清液0.2 ml接种12日龄的SPF鸡胚尿囊液，收集24 h后死亡或72 h未死鸡胚的尿囊液，测定其HA效价，统计病毒分离率。
2 结果与讨论
2.1 灭活效果鸡胚接种11天，剖检发现两组对照鸡胚均出现胚体萎缩、脚趾蜷曲、肌肉营养不良等典型的AE病理变化。而各灭活AEV和卵黄抗体混合液组的鸡胚均发育正常。表明以上各种灭活方法均可对卵黄抗体中的禽脑脊髓炎病毒有效杀灭。
表3灭活禽流感-H9卵黄抗体对雏鸡攻毒的保护率(略)
2.2 灭活禽流感-H9卵黄抗体活性（雏鸡的攻毒保护率）灭活后的禽流感-H9卵黄抗体对攻毒雏鸡的保护率如表3。结果表明0.05％、0.1％和0.2％的甲醛分别在4℃和56℃，作用24～48 h和30 min，均可有效杀灭卵黄抗体中混有的禽脑脊髓炎病毒，而对灭活卵黄抗体活性检验（攻毒保护试验）证明上述各种灭活方法对卵黄抗体的活性没有明显的影响。本试验为采用普通鸡蛋制备卵黄抗体，通过适当的灭活方法，可有效防止同源卵传性疾病的传播提供了试验依据。但是作为消毒剂的甲醛其作用机理是使病原微生物蛋白质变性。高浓度甲醛对免疫球蛋白IgY活性可能会有影响，同时对动物机体的毒性也会增加，所以用于卵黄抗体灭活的甲醛浓度愈低愈好。建议禽流感-H9卵黄抗体灭活，采用0.05％甲醛4℃灭活24 h为佳。