苯巴比妥残留快速检测阻断ELISA试剂盒的研制及性能测定

　　苯巴比妥(Phenobarbital,PB)具有镇静、催眠等作用，在肉用畜禽生产中常被用作饲料添加剂，但PB存在神经、骨髓、致畸、致癌等毒性作用，其残留严重危害人们的身体健康，我国和世界上多数国家都严禁PB用作饲料添加剂。目前，国外已开发出PB残留检测的ELISA试剂盒，如德国Dade Behring公司等，国内尚未见报道。本研究应用杂交瘤技术在制备出PB单克隆抗体(mAb)基础上，成功研制出PB残留检测阻断EILSA试剂盒(PBKit)，并对其性能进行了测定，现报告如下。

1 材料与方法 

1.1 材料与仪器 PB，Sigma产品，纯度≥99.0%；包被抗原(OVApAPB)、羊抗鼠酶标二抗(GaMIgGHRP)、抗PB mAb 4E6C7杂交瘤细胞株，本实验室制备、鉴定并冻存；其他试剂市售所得，AR级。550型酶标仪，美国BioRad公司；ELx50型洗板机，BioTEK公司；AE260电子天平，Mettler公司；3K18高速冷冻离心机，Sigma公司。

1.2 PBKit的研制 (1)PB mAb与GaMIgHRP最佳工作浓度的确定：用方阵法确定PB mAb和GaMIgGHRP的工作浓度。(2)阻断ELISA方法的建立：用0.01 mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)配制PB标准品，浓度分别为0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/L共9个，用阻断ELISA测定PB mAb对不同浓度PB标准品的抑制效价。(3)标准曲线的绘制与曲线拟合：根据阻断ELISA所测抑制效价，以吸光率B/B0(B是PB不同标准浓度的OD

450值，B0是PB0标准浓度的OD450值)为纵座标，以不同标准品浓度的对数值为横座标，在半对数座标纸上绘制标准曲线，推导回归方程，进行回归分析。(4)PBKit的配置：组成为OVApAPB包被并封闭好的8×12孔酶标板，C1号液(最佳工作浓度的PB mAb)，C2号液(最佳工作浓度的GaMIgGHRP)，C3号液(底物缓冲液A)，C4号液(底物缓冲液B)，C5号液(终止液)，PB标准品1～9，洗液(PBST)等。

1.3 样品预处理及PBKit的操作 (1)样品预处理：饲料样，称取10.0 g样品，加入40 mlPBS和5 ml 1 mol/L NaOH溶液，搅拌30 min，过滤，滤液用1 mol/L HCl调pH值7.2～7.4，处理后的样品已稀释5倍，测定结果相应扩大5倍；猪尿样，一般可直接用于检测，若浑浊不清，可过滤，取滤液用于检测。(2)PBKit的操作：第一步，根据待测样品数量取出所需酶标板并标记对照孔和样品孔，样品也加入C1号液和待测样品各50 μl(对照孔加PBST)，室温孵育15 min，PBST洗6次；第二步，每个样品孔加入C2号液50 μl，室温孵育25 min，PBST洗6次；第三步，每孔加入C3、C4号混合液100 μl，室温反应10 min，加入C5号液100 μl终止反应；第四步，用酶标仪读取各孔OD-450值。结果判定，根据各样品的B/B0值在标准曲线上求出其对应的质量浓度，或代入回归方程计算样品质量浓度的对数值x，求其反对数，即为样品中所含PB的质量浓度。

1.4 PBKit的性能测定 (1)灵敏度：阻断ELISA测定20个不同批次的空白标准品，计算OD-450值的平均值(X)和标准差(SD)，按照公式LOD%=(X-2SD)/X×100%进行计算，在标准曲线上查出对应的PB质量浓度为该试剂盒的理论检测限(LOD)。(2)准确度：将PB以终浓度分别为2、8、32、64 μg/L添加到饲料样、猪尿样中，设6个重复，以回收率和变异系数确定其准确度。(3)精密度：取不同批次的6批试剂盒，分别在6天测定PB浓度为2、8、32、64 μg/L的饲料样、猪尿样，设6个重复，以批内和批间变异系数确定其精密度。(4)特异性：PB及其结构相似物巴比妥类作为抑制物，用阻断ELISA测定各抑制物在0～3 200 μg/L范围的OD-450值，应用4参数logit法拟合曲线，根据Shelver推导的公式B/B0=(A-D)/［1+(x/B)C］+D计算PB mAb对PB与各抑制物的IC-50，按照公式CR%=(PB的IC-50/抑制物的IC-50)×100计算其交叉反应率(CR%)。(5)基质效应性：将PB分别溶于PBS、饲料样处理液，猪尿样处理液3种基质中，终浓度为0、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/L，按照PBKit的操作方法绘制曲线进行比较分析。(6)保存期：取同一批次试剂盒保存于4℃，观察保存1、30、60、90、120、150、180天后的检测结果，确定其保存期。

2 结果

2.1 阻断ELISA方法的建立 方阵法确定PB mAb与GaMIgGHRP的工作浓度分别为1∶3200、1∶1000。PBKit标准曲线见图1，曲线呈典型的S型，符合4参数logit曲线拟合，回归方程为y=-33.932x+85.792,相关系数为R２=0.9902，I-C50为11.35 μg/L，检测范围为1.0～128.0 μg/L。

2.2 灵敏度测定 阻断ELISA检测20个不同批次的空白标准品，所得平均值X=ΣXi/

n=1.024，标准方差S=｛［n×ΣX２-(ΣX)２］/［n×(n-1)］｝1/2=0.068，LOD%=(X-2S)/X×100%=86.7%，代入曲线回归方程计算出LOD=0.94μg/L，即灵敏〖HJ４／９〗度为0.94 μg/L，但考虑到实际检测工作的需要和用户操作方面的误差，该PBKit的检测限确定为1.0 μg/L。

2.3 准确度测定 结果见表1，饲料样的回收率在78.5%～84.7%，平均81.5%，变异系数在8.5%～12.3%，平均10.7%；尿样的回收率在85.5%～-91.3%，平均89.5%，变异系数在7.3%～10.4%，平均9.1%；平均变异系数均小于15%，表明PBKit具有较高的准确度。

2.4 精密度测定 结果见表2，饲料样、猪尿样的平均批内变异系数分别为10.08%、10.03%，平均批间变异系数分别为6.54%、5.71%，平均批间变异系数均小于平均批内变异系数，且不超过15%，表明PBKit具有较高的精密度。

2.5 特异性测定 结果见表3，PBKit的IC-50为11.35 μg/L，说明PBKit与PB可特异性结合，与巴比妥的CR%为8.4%，与其他巴比妥类药物的CR%均小于0.5%。

2.7 保存期测定 结果见表4，随着PBKit保存期延长，各标准品的OD-450值有所减小，但其IC-50、R２变化不大，曲线拟合良好，说明PBKit在4℃ 6个月保存期内质量稳定。

3 讨论 

3.1 阻断ELISA方法的建立 根据抗原抗体反应动力学原理，ELISA可分为竞争和非竞争两种，每种又可分为均相与非均相两种模式，本试验采用非均相间接竞争模式，表示为：Ag+Ag+mAb=AgmAb+AgmAb+Ag+Ag+mAb，式中Ag为待测游离抗原，Ag为包被抗原，mAb为特异性抗体，AgmAb为游抗原与抗体复合物，AgmAb为包被抗原与抗体复合物。将Ag包被于固相载体，Ag与Ag共同竞争mAb上的有限位点，反应平衡后洗脱多余的Ag与Ag，用酶系统显示AgmAb、AgmAb的结合情况，进推算Ag在样品中的含量或定性。经试验证实，本系统灵敏、准确、特异，可用于PB残留检测。

3.2 PBKit的质量特性 敏感性是由抗体的亲和力大小所决定的，James等认为，亲和常数(Ka)为107～1012L/mol抗体亲和力高，试验所用PB mAb经Batty法测定其Ka为2.08×1010L/mol，亲和力高，灵敏度好，检测限为1 μg/L；准确性是由标准曲线标准点的设置决定的，过低或过高均影响定量结果，本试验所设标准点

通过添加回收试验证实，线性关系好，检测范围为1.0～128.0 μg/L；特异性是由抗体的特异性所决定的，通过交叉反应试验证实，PBKit特异性高，可用于PB的残留检测。