目的采用FPLC系统提取纯化可溶型I型胶原蛋白(cⅡ)。方法采用鸡剑突软骨，经胃蛋白酶消化离心，再使用FPLC系统进行DEAE Sepharose FF高教液相离子交换层析和脱盐柱脱盐，得到纯化的CⅡ。结果自提的CⅡ纯品与CⅡ标准品电泳结果带型一致。结论本法提纯蛋白效率高，重复性好，快速简便。
[关键词] 可溶型Ⅱ型胶原蛋白;FPLC系统
胶原蛋白是人体组织中含量最丰富的蛋白之一。它分为12型，其中Ⅱ型胶原蛋白(typeⅡcollagen，C Ⅱ)是目前类风湿性疾病研究中的热点。已有大量的研究表明：CⅡ参与类风湿性关节炎的病理过程：在类风湿性关节炎病人及实验动物模型的血清及关节腔液中均存在抗CⅡ抗体或含有C I的免疫复合物，且抗体水平与关节炎症的活动度呈正相关 。国内外均有通过口服CⅡ诱导免疫耐受治疗类风湿性关节炎的研究报道，该方法有可能成为一种简便、安全、有效的新型治疗方法。但是Ⅱ型可溶型胶原蛋白国内还无批量生产，所用试剂依赖于国外进口，价格昂贵，不宜于CⅡ的广泛应用。目前国外文献报道的提纯方法为蛋白粗提后，采用DEAE纤维素柱纯化CⅡ．然后用高浓度的NaCl反复抽提，将CⅡ沉淀回收 。此方法不仅耗时长，提纯效率低，重复性差，而且容易出现明显的胶原沉淀的浮游现象．并且所获得的胶原中含有微量的硫酸软骨素(糖蛋白)，影响CⅡ的实际应用效果 。为此，我们对传统提纯方法进行了改进，并对两种方法进行了比较。
1 材料与方法
1．1 材料软骨取自鸡剑突软骨；CⅡ标准品为Sigma公司产品。
1．2 仪器快速蛋白液相层析系统(FPLC系统．Pharmacia公司产品)；匀浆器(波兰Warszawa公司产品)；冷冻离心机(Sigma公司产品)；电泳仪(Bio-Rad公司产品)。
1．3 胶原蛋白的粗提取参照参考文献，将软骨去除筋膜及骨化部分．用匀浆器粉碎。用pH 7.4的0.05 mol／L Tris／2 mol／L MgCl3 溶液洗涤软骨粉末．再用蒸馏水洗涤2遍。将软骨粉末悬浮于0.5 mol／L醋酸中，pH调至2.5左右，加入胃蛋白酶(Sigma公司，按1：50湿重加入)．4。C下消化72h．轻微震荡。4。C离心，20000×g20rain．取上清液沉淀物再次悬浮于0.5 mol／L醋酸中，同样条件下胃蛋白酶重复消化、离心2次。将3次上清液混匀，用pH7.6的0.05 mol／L Tris／0.2 mol／L NaC1液透析过夜。
1．4 高教液相离子交换层析纯化之前蛋白和透析液经0.22μm 滤膜过滤。然后采用FPLC 系统DEAE Sepharose FF离子交换层析对胶原蛋白粗提取物进行纯化。层析柱为C1O／2O，柱填料使用DEAE Sepharose Fast Flow，流速2mL／min，柱温为室温．紫外分光波长检测用280 ilm 洗脱液A液：
0.05 mol／L Tris／0.2 mol／L NaC1．B 液：0.05 mol／L Tris／2 mol／L NaCl。
1.5 脱盐柱脱盐并进一步纯化离子交换层析后纯化的蛋白经 HiTrap Desalting脱盐柱脱盐，洗脱液为去离子水，脱盐后蛋白保存在pH4 的0.1 mol／L醋酸中
1.6 电泳采用SDS PAGE电泳，将自提CⅡ纯化后的样品与标准品C I进行了比较
2 结果
2．1 DEAE离子交换层析后结果粗提蛋白经DEAE离子交换层析后出现2个主要的蛋白峰。第一个蛋白峰在加样后不久、尚未开始洗脱时即出现，为杂蛋白峰。第二个蛋白峰在B洗脱液浓度6O%左右出现，为C I蛋白峰。
2．2 脱盐柱脱盐后经过脱盐柱后．蛋白首先被洗脱．并且蛋白被分成2个峰。先出的大蛋白峰为CⅡ蛋白峰，后出的小蛋白峰为杂蛋白峰。紧接着CⅡ蛋白峰被洗脱的为盐类小分子，两者被明确分开。
2．3 蛋白纯化的稳定性和重复性为同一批蛋白粗提物，在同一天分5次经DEAE离子交换层析纯化后CⅡ蛋白峰的有关数据，结果表明这种方法稳定性、重复性好。
2．4 CⅡ蛋白提纯效率按下公式计算：
蛋白回收率=脱盐柱或高浓度NaC1反复抽提后CⅡ的含量／DEAE离子交换层析后提取的CⅡ含量
脱盐柱处理后的CⅡ蛋白回收率为83.4% ，而传统方法采用3 mol／L NaCI反复抽提后CⅡ的回收率为63.8%。
2．5 电泳结果分析，经DEAE Sepharose FF离子层析柱及脱盐柱2次纯化后的蛋白．在300000u处出现单一条带，与标准品带型一致。
3 讨论
类风湿关节炎(RA)是一种常见的自身免疫病，目前认为CⅡ在RA的发病中起重要作用，可能是种重要的自身抗原。在动物模型中，口服CⅡ能有效地防治胶原诱导的关节炎、佐剂诱导的关节炎。口服耐受治疗须采用可溶型CⅡ才能收到良好的效果．而CⅡ的溶解度很容易受pH值和盐浓度的影响；使得可溶型CⅡ的提取、纯化具有一定难度。但是现无国产CⅡ，需要依赖国外进口试剂，使对CⅡ的广泛研究受到了限制。我们在Trentham 的方法上进行了改进，对CⅡ进行了提纯、鉴定，发现改后的方法有许多独特的优点。
① 提纯效率高：CⅡ在酸性环境中能长期稳定，在中性条件下则很快降解为多肽片段。在经过离子交换层析后，样品收集液为中性，其中所含盐离子浓度较高，因酸性环境中NaC1高于0.7 mol／L时CⅡ易出沉淀，故不能直接加入醋酸。传统的解决方法是采用高浓度3mol／L NaC1将蛋白沉淀，然后用0.5mol／L醋酸反复抽提，蛋白回收率(抽提后蛋白含量／抽提前蛋白含量)仅为60%左右。现采用Hi-Trap Desalting脱盐柱先将纯化后蛋白脱盐，然后直接保存在醋酸中。这种方法回收率高，可达83%。
② 提取时间短：传统的方法由于需要反复抽提，耗时长，约24h左右，而且重复性不好。而采用脱柱的方法实验时间缩短，仅需几十分钟。
③ 蛋白纯度高：脱盐柱的柱填料为Sephadex G-25 Superfine，能起到分子筛的作用，因此在脱盐的同时，将一些等电点与CⅡ相同，但分子量较小的蛋白质去除．使CⅡ的纯度进一步提高。
④ 方法简便、实用性强：采用FPLC系统，只需事先编好程序，上样、洗脱、收集等步骤均可自动进行.还可通过循环程序.自动重复操作，图2所示即为10个脱盐循环的结果。而传统提取方法人工操作烦琐，费时费力。离子交换层析柱及脱盐柱均可上百次重复使用，效果仍然十分稳定，故本方法实用性较好。经过动物实验的验证，我们自提的CⅡ具有良好的生物活性，在佐剂型关节炎动物模型的治疗中取得了较为满意的结果。鉴于以上所获实验结果，我们认为该法是一种较理想的可溶型CⅡ的提取纯化方法，适合采用。
