摘 要：DNA疫苗又称为核酸疫苗，是20 世纪90 年代初发展起来的一种全新疫苗，具有能够激发机体体液和细胞免疫反应，核酸疫苗因高效、持久、广谱、简便、廉价、无致病性等特点， 被作为一种新型的疫苗而得到广泛的研究和应用，是近年来研究的一个热点。抗原编码基因的选择、质粒的构建、各种佐剂的应用以及疫苗接种方法和途径等因素可以提高和改变DNA 疫苗的免疫效果与反应类型。DNA疫苗不仅有预防疾病的作用， 同时还具有治疗疾病的作用。在不久的将来，DNA疫苗有望成为人类防治疾病的重要手段。
关键词：DNA 疫苗；抗原基因；免疫机制
DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的新型疫苗，是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第3代疫苗。DNA疫苗(DNA vaccine)是由插入一种或多种外源基因的质粒DNA(来自细菌)和真核启动调控基因等元件构成的，载有外源抗原的质粒DNA在一种真核启动子和加尾信号以及相关增强子等基因单元的控制下，可在哺乳动物的各类细胞中表达出相关的抗原蛋白[1]。将重组有外源抗原编码基因的质粒，利用某种方法直接导入人或动物的细胞内，通过宿主细胞的转录系统，在被免疫对象机体的活体细胞合成抗原蛋白，从而诱导机体产生免疫应答。
1 DNA疫苗的组成
DNA疫苗由病原抗原编码基因及质粒载体两部分组成。抗原基因可以是单个基因或完整的一组基因，也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列。DNA疫苗载体质粒一般以质粒为基本骨架。常用的质粒载体有pSV2、pRSV、pcDNA3.1、pCI和pVAX1等。这些源于大肠埃希菌的质粒载体可在 真核细胞中表达外源基因，理论上，它们的结构包括两种不同的单元促使抗原合成的转录复合单元，一套用于表达大肠埃希菌，另一套用于在宿主细胞内表达。它含有一启动子/增强子，带有功能性剪接供体和受体位点的内含子，编码抗原蛋白的基因序列以及多聚polyA加尾信号，启动子多采用CMV、SV40、RSV、LTR及 肌动蛋白启动子序列，它们都具有较高的转录活性，在多种动物细胞中能高效表达；原核细胞元件，如复制起点、多克隆位点以及有利于重组载体的构建并可加速其在细菌中增殖和扩增的选择标志，且质粒的基本骨架中还有促T细胞激活的免疫刺激序列(ISS)[2-3]。
2 CpG免疫刺激的作用
DNA疫苗中具有免疫刺激活性的结构基础是非甲基化的CpG基序(CpG motif)，又称为免疫刺激序列(immunostimulatory sequences，ISS)。
目前，寡核苷酸免疫刺激机理尚不清楚。含有CpG序列的寡核苷酸可刺激鼠B细胞增生和免疫球蛋白的产生，并可在体内及体外诱导T、B细胞和自然杀伤细胞分泌某些细胞因子，如IL-6、IL-12和IFN-γ。寡核苷酸的免疫调节作用与序列结构有关，一般认为B细胞有效的活化须具有5′端两个嘌呤、3′端两个嘧啶的CpG基序，能够序列特异性和非序列特异性地结合血清中的病毒和细胞蛋白，并非特异性地激活转录因子Spl[4]。CpG基序可诱生细胞毒性T淋巴细胞，这可能是因B细胞的活化促进了共刺激分子(CD86和CD25)的表达，或因CpG基序改变了T细胞对T细胞受体活化信号的敏感性而造成。Sato等发现，将β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因整合入含卡那霉素抗性基因的质粒后，表达β-Gal的水平比整合到含氨苄抗性基因的质粒要高， 但诱导的抗β-Gal的抗体水平则相反。进一步研究发现， 氨苄抗性基因中含有两个重复的未甲基化的AACGT序列，而卡那霉素抗性基因则没有。将此序列插入含卡那霉素抗性基因的质粒载体中可提高诱生抗β-Gal的抗体水平，并有效地诱导产生了较高的IgG、CTLs和IFN-γ。AACGT是已经证实了的具有免疫刺激活性的CpG基序，因此人们设想可以把DNA疫苗结构分为编码抗原区和骨架区，期望可以通过增加骨架结构中的免疫刺激CpG基序提高疫苗的免疫效果，但还需更多研究[5-7]。
研究发现CpG基序常以PuPuCpGPyPy的形式出现于细菌基因组DNA序列和质粒中，出现频率为1/16；而脊椎动物中较少，出现频率为1/50。原核细胞CpG中的胞苷酸的甲基化不足5%，而真核则达70% ～90%。对于脊椎动物免疫系统来说，能够识别原核生物DNA 中以未甲基化的CpG为核心的CpG序列，产生免疫激发，而且针对CpG两侧不同的脱氧核苷酸顺序分泌不同种类的细胞因子。
3 DNA疫苗的免疫应答机制
DNA质粒被导入宿主细胞后，病原体抗原的基因片段在宿主细胞内得到表达并合成抗原，再经过加工、处理、修饰递呈给免疫系统，激发免疫应答。这一过程类似于病原微生物感染或减毒活疫苗接种，所以DNA疫苗能有效地激发体液免疫和细胞免疫，尤其是其具有激活杀伤性T淋巴细胞的作用。
3.1 细胞介导的免疫反应
3.1.1 MHCⅠ途径 DNA疫苗接种机体后，质粒被周围细胞摄取并被细胞质中的酶复合物-蛋白酶体所降解，形成9个～13个氨基酸的肽段，然后经抗原转运蛋白(TAP)转运至内质网腔进一步修饰成8个～10个氨基酸的短肽。这些短肽(抗原表位)片段在内质网腔与新合成的MHCⅠ分子的抗原结合槽相结合，形成抗原肽-MHCⅠ分子复合物，并经高尔基体转运至细胞表面作为免疫原信号供CD8＋ CTL所识别，导致其活化、增殖并分化为具有杀伤能力的效应CTL(Tc)，诱导产生较强的细胞免疫反应[3,9]。这些效应Tc细胞可以类似于NK细胞的机制，通过释放穿孔素和颗粒酶杀死病毒感染的细胞，使其发生溶解从而限制病毒感染的扩散。此外，效应CTL还可通过产生细胞因子等非溶细胞机制来抑制病毒。