鸡体内硫酸黏杆菌素残留消除规律研究

　　硫酸黏杆菌素为黏杆菌素的硫酸盐，又名硫酸抗敌素、硫酸多黏菌素E。硫酸黏杆菌素对大部分革兰氏阴性菌有强大的杀菌作用，其作用机制目前尚不十分清楚。由于其抗菌作用强、残留低、不易产生耐药性，中国、美国、欧盟和日本等许多国家批准作为饲料添加剂或兽药。随着其在养殖业中日益增多的应用，动物性食品中硫酸黏杆菌素的残留问题也已受到各国的重视。本试验在国内首次用微生物方法研究硫酸黏杆菌素在肉鸡体内的消除规律，目的旨在为合理制定动物用药休药期提供科学依据。

1 材料

1.1 实验动物 1日龄AA肉雏鸡51只，购自北京华都肉联公司。

1.2 饲料与疫苗 肉鸡全价配合饲料，中国农业科学院畜牧研究所（不含任何抗菌药物）；鸡新城疫Ⅱ系弱毒苗，北京海淀中海动物保健科技公司，批号：020822；传染性法氏囊疫苗，北京海淀中海动物保健科技公司，批号：020716；马立克氏疫苗，北京海淀中海动物保健科技公司，批号：020724。

1.3 药品 硫酸黏杆菌素标准品，MEIJI，SEIKA，KAISHA，LTD Lot No. COLWS1716 749 μg/mg；硫酸黏杆菌素原粉，山东鲁抗进出口公司18960 IU/mg。

1.4 菌种 支气管炎博代特氏菌（Bordetella bronchiseptica）ATCC4617。

2 试验方法

本研究所涉及到的玻璃器皿均在160℃高温下干热灭菌2 h；塑料器皿和所用溶液均在121℃高压灭菌15 min；所配制培养基在121℃高压灭菌15 min。

2.1 饲养管理 实验肉鸡笼养，免疫程序按种鸡场提供的程序进行：雏鸡出壳当天颈部皮下注射马立克氏疫苗；7日龄时用鸡新城疫Ⅱ系弱毒苗滴鼻；15日龄用传染性法氏囊疫苗饮水。

2.2 实验动物分组 1日龄健康肉鸡51只，饲喂四周后，随机分为3组，第1组（3只）为空白组，第2组（18只）为低剂量给药组，第3组（30只）为高剂量给药组。通过饮水给药，低剂量组给药量为60 mg/L，高剂量组给药量为300 mg/L，连续给药7天。

2.3 采集样本 实验肉鸡在连续7天饮水给药后停药，空白对照组于停药0 h屠宰，低剂量组分别于停药后0 h、4 h、8 h、12 h、24 h及72 h屠宰，高剂量组分别于停药后0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、2天、3天、4天、5天和7天屠宰，每次屠宰3只，分别取肌肉（胸肌），肝脏（全肝）和肾脏，于-20℃冷冻保存，样本于临分析前解冻。

2.4 样品的提取与测定

2.4.1 硫酸黏杆菌素标准品贮备液制备硫酸黏杆菌素在小于0.67千帕的真空度下干燥3 h，精确称量干燥标准品溶于灭菌磷酸盐缓冲液（pH6.0），配制成终浓度为1 000 μg/ml的贮备液,于0～4℃存放不超过一个月。

2.4.2 平板的制备 加15 ml融化的基础培养基于培养皿中，均匀铺平，在水平面上待其凝固。加一定量新制备的菌悬液于冷却至52℃的基础培养基中，混匀后将5 ml培养基注入一个平皿中，将培养皿两边倾斜并作圆周旋转运动使培养基均匀分散铺平，待其凝固，此平板需在制备后的1小时内使用。

2.4.3 待测样液的制备 样品于临分析前解冻，取10 g肌肉组织加9.5 ml PBS（pH6.0），中速振荡30 min，样品于100℃水浴中加热3 min去蛋白，3500 r/min离心15 min，上清液用1N NaOH调节pH值至6.0，用0.22 μm针头式滤器除菌备用。分别取肝脏和肾脏组织各10 g，分别加入8.1 ml 5％硫酸，中速振荡30 min，饱和氢氧化钠1.4 ml中和，3 500 r/min离心 15 min，上清液用1N NaOH将pH值调至6.0，0.22 μm针头式滤器除菌备用。2.4.4 药物浓度测定 培养平板上等距离放置6个牛津杯，其间隔在半径3 cm上约成60°角，在三个间隔的牛津杯中滴加参照浓度溶液 ，其余3个牛津杯中加入其他浓度中的一个。18℃静置2 h，于培养箱中培养20 h。除参照浓度外每一浓度使用3个平板。平板培养之后，用游标卡尺测量抑菌圈直径（精确度0.02 mm），测量每一浓度3个培养平板上9个参照浓度抑菌圈直径和9个另一浓度抑菌圈直径，并求出平均值；求出所有平板上参照浓度抑菌圈直径的平均值，并根据此平均值对其他浓度的平均值进行矫正。以药物浓度的对数值为纵座标，平均抑菌圈直径的矫正值为横座标绘制标准曲线。通过标准曲线查出待测样液的药物浓度。

将药物浓度乘以2得到样本的药物浓度。

3 结果与分析

实验肉鸡连续7天饮水给药，肌肉高剂量组和低剂量组在停药后各阶段均未测得有硫酸黏杆菌素残留。肾脏和肝脏低剂量组在停药后各阶段均未测得硫酸黏杆菌素的残留，高剂量组在停药0 h可测得有微量残留，其试验数据如表1。〖FL)〗〖HT4.〗〖HJ0〗〖HJ〗〖HT〗

表1 肌肉、肝脏和肾脏残留试验数据

4 讨论

文献资料报道硫酸黏杆菌素口服给药无药物残留,但是注射给药和超大剂量(治疗剂量5～10倍)口服给药会在机体组织中造成微量残留。SATO等给鸡食管灌注25 mg/kg和50 mg/kg两个剂量，肌肉和肝脏在停药后1～8 h均未检测到药物的残留,肾脏两个剂量组在停药2 h检测到微量残留但未达到可检测的水平。我国和欧盟规定的硫酸黏杆菌素最高残留限量肌肉、肝和肾分别为150 μg/kg、150 μg/kg和200 μg/kg，本试验以高(300 mg/L)、低 (60 mg/L) 两个剂量组给鸡连续饮水给药7天，低剂量组肌肉、肝脏和肾脏组织均未检测到药物的残留,高剂量组在停药0 h肝脏和肾脏检测到微量药物残留，但未达到可检测的水平。这与上述资料所报道的试验结果基本一致，本试验300 mg/L的饮水给药量为药典规定用药量的5倍，连续饮水给药7天停药，残留量没有超过我国和欧盟最高残留限量标准，说明通过口服途径给药在鸡体内不易造成残留。具体硫酸黏杆菌素休药期的确定，还需进一步的研究。