摘 要：2006年5月，黑龙江省大庆市某牛场发生一起产后奶牛急性死亡病例，以败血症为特征。经过病原分离鉴定以及动物试验等方法最终确诊为肺炎链球菌感染。药物敏感性试验表明，该细菌对青霉素G、先锋霉素Ⅴ和菌必治等高度敏感，对红霉素、乙酰螺旋霉素和林可霉素等具有耐药性。
关键词：奶牛；肺炎链球菌病；诊断治疗
牛肺炎链球菌病是由肺炎链球菌引起的一种急性败血性传染病。主要发生于犊牛，曾被称为肺炎双球菌感染。患畜为传染源，3周龄以内的犊牛最易感。主要经呼吸道感染，呈散发或地方性流行[1]。2006年5月，黑龙江省大庆市某奶牛场发生一起3岁产后奶牛急性死亡病例。从病死牛肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结内分离到一种革兰氏阳性双球菌，经过生化试验确定为肺炎链球菌。通过药物敏感性试验，表明其对先锋霉素Ⅴ和青霉素G高度敏感，对林可霉素、红霉素、乙酰螺旋霉素和甲氧苄胺嘧啶等具有耐药性。现将本次试验报道于后，供奶牛养殖临床参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料 无菌采集病死牛肝脏、脾脏和肺脏。
1.1.2 培养基 按常规方法制备血琼脂培养基、三糖铁、麦糠凯、伊红美蓝琼脂和脑心浸液(BHI)。
1.1.3 生化管及药敏片 脱氧胆酸钠购自Sigma，生化管及药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。生化管批号：20060418；药敏纸片批号：20041016。
1.1.4 实验动物 18 g～20 g 健康Balb/c昆明小鼠，购自哈药集团黑龙江省生物制品一厂。
1.2 方法
1.2.1 流行病学调查及病理学观察 对病死牛进行系统的流行病学调查及病理学观察，以便于进一步了解其发病特征。
1.2.2 组织抹片镜检 无菌取病死牛心血、肝脏和脾脏制成组织抹片，然后进行革兰氏镜检。
1.2.3 细菌分离培养 将肝脏、脾脏和肺脏接种新鲜80 mL/L绵羊血液营养琼脂平板，分别作需氧和厌氧培养，置于37 ℃ 恒温箱24 h 后观察结果。厌氧培养使用烛缸法，具体方法是将接种完病料的血平板倒置于厌氧罐内，然后点燃罐内蜡烛，待其燃烧稳定后，立即盖上盖，接口用凡士林密封，再用线绳固定盖。待蜡烛自然熄灭后将厌氧罐置37 ℃培养。将培养物进行革兰氏染色及镜检，再进行纯培养，将纯培养物接种BHI,37 ℃需氧培养，24 h 后观察结果。
1.2.4 生化试验 按常规方法进行生化试验[2]。
1.2.5 药敏试验 纸片法进行药敏试验，37 ℃需氧培养24 h后，观察结果[2]。
1.2.6 溶菌试验 用BHI 24 h 纯培养物4 mL，浓缩制备1 mL生理盐水浓菌悬液，pH调至7.0，分装两支试管，各0.5 mL。其中一管加0.5 mL 100 g/L去氧胆酸钠为试验管，另一管加0.5 mL生理盐水作对照。35 ℃孵育，每小时观察1次结果。
1.2.7 动物试验 把10只体重18 g～20 g Balb/c小鼠随机分为两组，每组5只。一组接种分离菌株24 h BHI 培养物，每只0.2 mL作为试验组；另一组每只小鼠接种0.2 mL无菌的BHI作对照，观察1周。
2 结果
2.1 流行病学及临床症状
该牛场卫生、饲养管理和产期护理等条件良好。共计有600头成年母牛，均是2004年从澳大利亚进口，2006年3月曾经死亡1头产后母牛，剖检病理变化与本次病死牛相似。本次病牛营养状况一般，于2006年5月3日分娩，5月6日发现发病，表现腹式呼吸，呼吸困难，心跳加快，心音增强，口角流涎，起卧不定。体温39 ℃，脉搏134次/min，呼吸54次/min。从出现症状到死亡仅1 h。
2.2 剖检病理变化
舌半脱出，口角流出大量泡沫样血液，皮下有散在出血斑，腹腔积液，瘤胃、瓣胃和真胃黏膜散在出血点和出血斑；肠系膜大面积出血，肠系膜淋巴结水肿，整个肠道弥漫性出血，肝脏肿大质地较脆，胆囊增大5倍～8倍，胆汁酱油色，胆囊壁增厚，黏膜雪花状出血。脾脏肿大质地坚硬似橡皮，被膜出血，脾尾有淤血斑。气管黏膜弥漫性出血，肺支气管有大量泡沫，肺脏肿大， 肺质地较脆，大理石样外观， 肺间质胶冻样水肿，左肺尖叶严重出血，右肺尖叶切开有大量血样泡沫。心外膜及心内膜都有出血点及出血斑，子宫肌水肿，孕角黏膜散在大量出血斑，肾脏未见异常。
2.3 组织抹片镜检结果
有少量革兰氏阳性成对球菌，暗视野可见明显的荚膜。
2.4 分离培养结果
在80 mL/L绵羊血平板上，需氧培养和厌氧培养的条件下，均培养出同一种细菌。在厌氧条件下出现明显的β溶血，需氧条件下呈α 溶血，表面光滑、湿润、边缘整齐、灰白色小菌落。在麦糠凯培养基和伊红美兰培养基上不生长。在BHI中呈絮状沉淀悬浮在试管底部。革兰氏阳性双球菌，菌体呈卵圆形、瓜子仁状，直径0.5 μm～1.25 μm。
2.5 生化试验结果
该细菌能发酵蕈糖、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、山梨醇、果糖、乳糖和麦芽糖，β-乳糖苷酶阳性；能水解水杨苷、七叶苷，VP反应阳性，不能水解马脲酸，不能发酵甘露醇、淀粉、蜜糖、卫矛醇、棉籽糖、阿拉伯糖、木糖，接触酶阴性。根据文献[3]该生化指标基本符合链球菌属。
2.6 溶菌试验结果
孵育1 h试验组菌液与对照相比较无变化，2 h变得清亮，底层有少量沉淀。据此判定溶菌试验阳性。结合生化试验结果最终判定该细菌为肺炎链球菌肺炎亚种。
2.7 药敏试验结果
根据药物敏感性试验确定本次分离到的肺炎链球菌对青霉素G、先锋霉素Ⅴ、氯霉素、苯唑青霉素和菌必治等5种药物高度敏感；对氨苄青霉素、新生霉素、 壮观霉素、环丙沙星、卡那霉素和庆大霉素等6种药物中度敏感；对红霉素、甲氧苄胺嘧啶、 乙酰螺旋霉素、 林可霉素和链霉素等6种药物具有耐药性(表1)。
表1 药敏试验结果
2.8 动物试验结果
试验组小鼠在24 h 内全部死亡，死亡的小鼠脏器都有出血点，并从死亡小鼠脏器内分离到注射的相应细菌。对照组未见异常。
3 讨论
3.1 通过流行病学调查、临床症状、病理变化、病原分离鉴定和动物试验，确定该成年澳大利亚奶牛死亡是肺炎链球菌感染造成败血症所致。
3.2 当前我国奶牛集约化养殖方式迅速发展，百头或者千头以上的奶牛场越来越多，伴随着养殖规模不断扩大，一些新病不断出现，一些不常发生的传染病也有日益增加的趋势。通过对本次奶牛肺炎链球菌病诊断发现，传统上认为对犊牛易感的肺炎链球菌对成年奶牛也发生了感染。这可能是由于围产期母牛机体抵抗力下降，再加分娩应激对机体的影响，从而为肺炎链球菌侵入、繁殖及发病提供了有利条件。肖定汉等[4]报道某奶牛场临产和产后奶牛暴发巴氏杆菌病，以及作者发现的产后奶牛肺炎克雷伯菌病和大肠埃希菌与溶血性曼氏杆菌混合感染等病例。说明临产和产后奶牛容易激发一些条件性病原菌感染，所以在奶牛生产实践中我们应该更加重视对围产期和产后奶牛的饲养管理，尽量减少经济损失。
3.3 通过药物敏感性试验发现该菌株对头孢类和青霉素类药物比较敏感，而对红霉素、甲氧胺嘧啶和乙酰螺旋霉素等药物具有耐药性。
